论文摘要
中药注射剂是在中医药制剂基础上发展起来的创新剂型,既保留了中医药特色,又具有西药注射剂起效快的特点,在既往的临床应用中表现出了突出的疗效,具有重要的临床应用价值,尤其在治疗疑难和急重症疾病方面具有独特作用。中药注射剂是当代中药剂型的突破性创新,但是存在有效成分不明确,质量控制不完善,药代动力学参数不清楚等诸多问题,对中药注射剂的临床安全用药产生了负面影响,因此,研究中药注射剂质量稳定性和药物代谢动力学特征具有重要的意义。中药注射液制备工艺复杂,影响因素较多,其质量的优劣,成分组成的稳定性,是临床安全有效和药物代谢动力学研究的基础。中药药物代谢动力学研究在创新中药与现代复方中药研发中发挥着重要作用,它将中药药理学与药物代谢动力学有机地结合,对阐明中药的药效物质基础和作用机制,揭示中药组方原理和配伍规律、指导临床合理用药等都具有重要意义。中药多组分共同发挥作用,某一成分的药代动力学难以代表整个中药或复方的药代动力学特征,而多组分药代研究方法学更为复杂,技术含量更高。因此,选择何种成分的药代动力学研究代表整个中药复方,如何定量表征中药复方的整体药代动力学特征,指导临床给药方案的制定,是中药药代动力学研究中迫切需要解决的问题。注射用肌萎灵冻干粉是由人参和淫羊藿组成的中药复方制剂,主要用于治疗运动神经元疾病。本课题旨在多成分定量的基础上,选择主要有效成分开展注射用肌萎灵冻干粉药代动力学研究,进行相关方法学的探索,获得多组分共存时各主要有效成分的药代动力学特性,有助于明确注射用肌萎灵冻干粉的物质基础、阐明其作用机制,为临床安全和合理用药提供依据。第一部分液质联用技术同时定性定量注射用肌萎灵冻干粉中15种成分目的:建立一种简单、快速、可同时定性定量测定注射用肌萎灵冻干粉中15种成分的HPLC-MS分析方法,并用于注射用肌萎灵冻干粉的质量控制。方法:以MRM-IDA-EPI扫描模式对注射用肌萎灵冻干粉中15种成分进行结构确证,采用电喷雾离子化源（ESI）,负离子多反应监测（MRM）模式建立含量测定方法。质谱条件:源喷射电压（IS）为-4500 V;雾化温度为650℃;雾化气（Gas 1,N2）为60 psi;辅助气（Gas 2,N2）为65 psi;气帘气（Cur,N2）为25 psi。15种被测成分用于定量分析的离子对分别为:m/z 1107.7→88.9（人参皂苷Rb1）,m/z 1077.5→88.9（人参皂苷Rb2和Rc）,m/z 945.6→88.9（人参皂苷Rd和Re）,m/z 799.5→59.0（人参皂苷Rf和Rg1）,m/z 783.5→58.9（人参皂苷Rg2、20（S）-Rg3和20（R）-Rg3）,m/z 721.2→513.1（淫羊藿苷）,m/z 837.2→675.2（朝藿定A）,m/z 807.3→645.2（朝藿定B）,m/z 821.3→659.3（朝藿定C）,m/z 463.1→300.0（金丝桃苷）。色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18,流动相为0.1%甲酸-乙腈,梯度洗脱,流速0.7 mL/min。结果:运用液质联用技术,确证了注射用肌萎灵冻干粉中15种化学成分,在检测浓度范围内,15种被测成分具有良好线性关系（r>0.999）。最低检测限和最低定量限分别为1.23 ng/mL和6.17 ng/mL,方法学考察日内和日间精密度均低于4.52%,回收率在96.11%101.24%,表明所建立的方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度。结论:本研究建立了一种灵敏度高,专属性好的分析注射用肌萎灵冻干粉中15种有效成分的HPLC-MS方法,能够在较短的时间实现对复杂的化合物分离与鉴定,对于注射用肌萎灵冻干粉的质量控制具有重要意义。第二部分注射用肌萎灵冻干粉主要有效成分在Beagle犬体内药代动力学研究目的:建立犬血浆中人参皂苷Rb1、Rg1、Re及淫羊藿苷定量分析的HPLC-MS方法,研究犬静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后,人参皂苷Rb1、Rg1、Re及淫羊藿苷在犬血浆中的药代动力学特征。方法:Beagle犬静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后,分别于给药后2、5、10、15、20、30、40min,1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96、144、192 h,右前肢静脉取血,制备血浆样品。采用甲醇沉淀蛋白的方法进行血浆样品的预处理,分别以地西泮和氯硝西泮为内标,色谱柱采用Restek Allure C18, 4.6×50 mm, 5μm,流动相为不同比例的甲醇:0.1‰甲酸水（v/v）,检测方式为正离子多反应监测（MRM）。结果:犬血浆中人参皂苷Rb1、Rg1、Re和淫羊藿苷在检测的范围内线性关系良好（r>0.997）,最低定量浓度为0.1μg/mL。日内、日间精密度相对标准偏差（RSD）均小于13.7%,相对误差（RE）在-0.67%8.67%。采用建立的方法测定了注射用肌萎灵冻干粉低、中、高三个剂量给药后血浆中人参皂苷Rb1、Rg1、Re及淫羊藿苷的浓度,绘制药-时曲线,采用DAD 2.0软件计算药代动力学参数。将剂量与Cmax、AUC0-t进行相关和回归分析,显示Cmax、AUC0-t与剂量呈现良好的线性关系。人参皂苷Rb1、Rg1、Re及淫羊藿苷在Beagle犬体内药动学具有线性动力学的特征。结论:本研究建立的方法简单、快速,可用于Beagle犬静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后的血浆中人参皂苷Rb1、Rg1、Re及淫羊藿苷的药物浓度测定,定量评价药代动力学参数和剂量之间的关系,为设计和优化临床研究给药方案提供参考依据。第三部分注射用肌萎灵冻干粉主要有效成分在大鼠体内靶组织分布研究目的:建立大鼠肌肉、脊髓、脑、坐骨神经4种组织中7种人参皂苷和4种淫羊藿黄酮苷定量分析的HPLC-MS方法,研究大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后其在靶组织中的分布。方法:大鼠单次静脉给予注射用肌萎灵冻干粉,分别于给药后30,60,120 min,取脑、脊髓、肌肉和坐骨神经,加蒸馏水匀浆制备组织样品,采用甲醇沉淀蛋白的方法进行组织样品的预处理,以染料木素为内标。色谱柱为Agilent C18柱,流动相为0.1%甲酸-乙腈（v/v）,梯度洗脱,流速0.7 mL/min。采用电喷雾离子源（ESI）,负离子多反应监测（MRM）扫描模式进行检测。结果:大鼠4种不同的组织中11种有效成分在检测的范围内线性关系良好（r>0.995）,最低定量浓度为4.40181 ng/mL。日内、日间精密度相对标准偏差（RSD）均小于9.8%,相对误差分别为-7.69.3%和-8.98.6%,平均提取回收率在93.3106%。大鼠单次静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后,在脑、脊髓、肌肉和坐骨神经中可检测到11种有效成分,其在坐骨神经中的分布远高于在脑、肌肉、脊髓中的分布。原人参二醇类化合物人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd进入体内能够快速分布到各个组织中,但是其消除较慢;原人参三醇类化合物人参皂苷Re、Rf、Rg1广泛分布在肌肉和坐骨神经中,而在脑和脊髓中分布较少。淫羊藿苷、朝藿定A、B、C的分布较为相似,在肌肉和坐骨神经中的分布远高于在脑和脊髓中的分布,分布速度快,消除速度也快。结论:本研究建立了灵敏、快速的LC-MS方法,用于测定大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后11种有效成分在4个靶组织分布,该结果为深入探讨注射用肌萎灵冻干粉治疗运动神经元疾病的作用机制提供参考。第四部分注射用肌萎灵冻干粉主要有效成分在大鼠体内排泄研究目的:建立高效液相色谱紫外检测器串联蒸发光散射检测器（HPLC -UV-ELSD）同时测定大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后人参皂苷类成分和淫羊藿黄酮苷类成分在尿和胆汁中的排泄,阐明注射用肌萎灵冻干粉主要有效成分在体内的主要排泄途径。方法:大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉,分别于给药后0-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24,24-48,48-72,72-96,96-120h收集尿样,于给药后0-2,2-4,4-6,6-8,8-2,12-24h收集胆汁样品。采用固相萃取的方法进行尿样和胆汁样品的预处理,以地高辛为内标。色谱柱采用Waters C18柱,流动相为乙腈:水（v/v）,梯度洗脱,流速为1 mL/min,紫外检测器检测波长:220 nm,蒸发光检测器:漂移管温度80℃,气体压力25 psi。结果:尿样品中检测的12种有效成分和胆汁样品中检测的6种有效成分在检测的范围内线性关系良好,精密度、准确度、提取回收率均符合要求。大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后,尿液中可检出12种有效成分,其中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、淫羊藿苷及朝藿定A、B、C通过尿从体内迅速排泄;人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd在尿中的排泄与前者显著不同,呈缓慢上升的趋势,96-120h尿液中仍可检测到,但在胆汁中却未检测到这4种成分。在胆汁中人参皂苷Rg1和Re可检出,但排泄量较少,分别占给药量的2.63%和5.31%,4h已基本排泄完全;淫羊藿苷、朝藿定A、B、C有部分通过胆汁排出体外,8h的排泄量均已占总排泄量的92%以上。结论:该法精密度好,重复性好,可用于大鼠尾静脉给予注射用肌萎灵冻干粉后体内药物排泄的研究,阐明大鼠静脉给予注射用肌萎灵冻干粉,人参皂苷类成分主要通过肾排泄,淫羊藿黄酮苷可通过肾和肝胆两种途径排泄。该法将HPLC-UV-ELSD串联,为既含有强紫外吸收成分,又含弱紫外吸收成分的复方制剂研究提供了新方法。第五部分注射用肌萎灵冻干粉主要黄酮类成分血浆蛋白结合率研究目的:研究体外注射用肌萎灵冻干粉中主要黄酮类成分淫羊藿苷、朝藿定A、B、C与人血浆的蛋白结合率,对比朝藿定C在单体和复方制剂中血浆蛋白结合率的变化。方法:利用平衡透析法结合HPLC法测定注射用肌萎灵冻干粉中主要黄酮类成分和单体朝藿定C的血浆蛋白结合率。采用甲醇沉淀蛋白的方法进行血浆样品的预处理,随行标准曲线计算透析袋内外药物浓度,获得血浆蛋白结合率。色谱柱为Waters C18柱,流动相为乙腈-水,流速为1 mL/min,检测波长为269 nm,柱温为25℃。结果:淫羊藿苷、朝藿定A、B、C在检测的范围内线性关系良好,在不同介质中的精密度和回收率均较好。注射用肌萎灵冻干粉血浆浓度分别为5、10、20 mg/mL时,其主要黄酮成分淫羊藿苷、朝藿定A、B、C与人血浆的平均蛋白结合率分别为69.98%、73.37%、67.67%;61.99%、62.15%、56.34%;57.30%、59.68%、56.49%;66.76%、67.74%、62.36%。朝藿定C与人血浆在25、50、100μg/mL浓度下的平均蛋白结合率分别为76.47%、72.40%、75.60%,与犬血浆在25、50、100μg/mL浓度下的平均蛋白结合率分别为73.99%、72.37%、69.96%。结论:体外注射用肌萎灵冻干粉中4种黄酮类成分与人血浆蛋白的结合均属中等强度结合,且蛋白结合率与血药浓度无明显依赖性。对比研究发现,注射用肌萎灵冻干粉中的朝藿定C与人血浆蛋白结合率明显低于单体朝藿定C与人血浆的蛋白结合率。朝藿定C单体与人血浆和犬血浆的血浆蛋白结合率无显著差异,且均与血药浓度无明显依赖性,提示注射用肌萎灵冻干粉在犬体内的药代动力学特征可能和人比较相似。第六部分液质联用技术研究朝藿定C在大鼠体内的代谢目的:建立一种简单、快速分析药物体内代谢产物的方法,并运用于朝藿定C在大鼠体内代谢产物的分析鉴定,阐明朝藿定C在大鼠体内的代谢过程和代谢途径。方法:利用三重四极杆-线性离子阱质谱仪,在正离子模式下研究朝藿定C的裂解途径,总结裂解规律。采用预期多反应监测-信息相关-增强子离子（pMRM-IDA-EPI）的扫描方式,通过与母体化合物比较质子化分子,MS2质谱以及保留时间的变化,分析朝藿定C在静脉和口服给予大鼠后胆汁、尿样、胃内容物、肠中的代谢产物。分别从大鼠胆汁样品和体外肝匀浆孵育的样品中分离得到两个代谢产物,采核磁共振光谱进行分析。结果:大鼠静脉给予朝藿定C后,尿液中检测出15个代谢物,胆汁中9个代谢物;而大鼠灌胃朝藿定C后,尿液中检测出15个代谢产物,胆汁中4个代谢物,胃内容物中7个代谢物,肠中3个代谢物,总计在大鼠体内检测出18个结构不同的代谢物。采用核磁共振技术对M3和M16两个代谢物的结构进行了确认。总结了朝藿定C在大鼠体内主要的代谢途径是水解,羟基化,脱氢,脱甲基,以及与葡萄糖醛酸或不同类型的糖的结合反应。结论:该方法特异性强,灵敏度高,分析速度快,适用于体内代谢产物的结构鉴定。为进一步研究注射用肌萎灵冻干粉中其它成分的代谢以及复方的代谢提供借鉴。
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