LuxS基因缺失对变形链球菌生长特性、耐酸性及蛋白表达的影响

论文摘要

目的:本实验利用PCR扩增等方法鉴定变链菌LuxS突变株,通过菌落培养、镜下观察等方法比较标准株与LuxS突变株在生长特性方面的异同,将标准株与LuxS突变株在一组pH值梯度的酸性环境下培养,并采用预酸化后再培养的方法比较两种菌株的耐酸性,通过双向电泳技术对比研究标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变链菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法:提取变链菌标准株及LuxS突变株基因组DNA,设计特定引物进行PCR扩增,扩增产物进行电泳以鉴定LuxS突变株。将标准株与LuxS突变株分别在含红霉素及不含红霉素的TSA固体培养基中作培养,观察两种菌落的生长情况并作常规生化检测、革兰氏染色涂片以比较两种菌株的生长特性。配制一组pH值跨度为3.5至7.0的BHI液体培养基,将标准株及LuxS突变株分别在其中培养,离心后细菌沉淀物用无菌生理盐水稀释,于紫外分光光度计600nm处测定吸光度A值,比较两种菌株在各pH值环境下的生长情况。将标准株及LuxS突变株在pH值5.5的BHI液体培养基中预酸化,然后接种于pH值3.0的BHI液体培养基中酸化,酸化前后分别取样稀释,涂布BHI固体培养基中培养,计数,推算出相应的菌液浓度,算出酸化前后菌液浓度之比值。提取变链菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果:LuxS突变株不能扩增出LuxS基因片段,而标准株可以扩增出。LuxS突变株可以扩增出红霉素抗性基因片段,而标准株不能扩增出。在不含红霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,镜下可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。在含红霉素的TSA-Eym?固体培养基中,标准株不能生长,而突变株的生长状况基本正常。pH值为5.0时,LuxS突变株的生长受到明显的抑制,而标准株仍保持了一定的生长态势。pH值为4.5时,标准株的生长受到明显的抑制,而LuxS突变株几乎没有发生明显的生长。两种菌株在pH值为5.5的培养基中预酸化后,抵抗致死性pH值环境杀伤的能力都有所增强,存活率都有所提高。与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低,其中17个点蛋白质表达量升高了100%以上,14个点蛋白质表达量减少了50%以上。结论:通过PCR扩增鉴定了变链菌LuxS突变株,并对标准株与LuxS突变株的生长特性作了初步的比较,确切证实了LuxS突变株构建成功并表达稳定,两种菌株在生长特性上有一定的差异性。标准株与LuxS突变株的耐酸能力具有差异,标准株的耐酸能力强于LuxS突变株,两种菌株均表现出了适应性耐酸的能力。LuxS突变株对酸灭活的敏感性增加,而适应性耐酸能力仍然存在。变链菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、变链菌LuxS突变株的鉴定及LuxS基因缺失对变链菌生长特性的影响
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、LuxS基因缺失对变链菌耐酸性的影响
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、LuxS基因缺失对变链菌蛋白表达的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 变形链球菌菌斑生物膜相关基因突变的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢