人食管癌细胞株EC-9706照射后细胞周期和凋亡的实验研究

论文摘要

背景和目的:食管癌是严重威胁人类健康的一种常见恶性肿瘤,其治疗目前仍以手术或放疗等局部治疗手段为主,其中以放射治疗为主的综合治疗占80%,但这两种局部治疗手段近十多年来的疗效较前并无明显改善。放射治疗癌症已有百年历史,放射治疗的目的是给予肿瘤组织一定强度的、均匀、准确的照射,而尽可能减少周围正常组织损伤。放射治疗作为食管癌的主要治疗手段之一,其作用是肯定的,但仍存在许多问题制约疗效。晚期食管癌因失去手术治疗机会,行单纯放疗5年生存率在10%以下。近年来,影像学技术、计算机技术和放射治疗技术的发展为食管癌和其它系统恶性肿瘤的治疗起到了巨大的推动作用。目前放疗设备不断改进,医务工作者为提高疗效进行了很多有益的尝试,食管癌放疗模式也不断创新,在常规分割放疗（CF）基础上提出后程加速超分割放疗（LCAHF）、三维适形放疗（3D-CRT）等,但这些都是在临床方法上进行的小心翼翼的改进,有些甚至只是调整一下顺序,总的来说未见大的突破,也较少有基础的放射生物学支持。放射治疗癌症的机理主要在于对遗传物质的损伤。随着生物学的进展,国外学者从细胞和基因表达等方面对辐射治癌机理进行了多角度的研究。有关放射治疗食管癌的基础研究,国内不多。本课题拟通过观察放射对人食管癌细胞株EC-9706的细胞周期和凋亡情况的影响,探讨食管癌细胞的放射生物学特性,为食管癌的放射治疗提供放射生物学方面依据。细胞周期（cell cycle）是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,分为合成期（S）与分裂期（M）两个阶段。在有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙G1和G2期,这样整个细胞周期可划分为G1→S→G2→M→G1。细胞受电离辐射作用后诱发DNA损伤、细胞周期调控紊乱和更为严重的后果—细胞死亡和细胞凋亡。细胞周期进程是严格有序的,细胞周期各时相中细胞发生的变化及相邻时相间的转换均受细胞自主及环境因素的控制。电离辐射可通过诱导细胞周期G1阻滞、G2阻滞、S期延迟和S/M解偶联从而影响细胞周期进程,其中细胞周期检查点（check point）在凋亡调控中发挥重要作用。研究表明细胞周期检测点参与肿瘤细胞的辐射抗性,是机体对外界刺激的一种保护性反应,目的在于保证生物体基因组的遗传稳定性。G1期阻滞和S期延迟可提供充足的时间来促使受损伤的DNA修复,或使处于S期的受损伤的DNA修复后再进行合成,损伤严重的细胞则通过凋亡被消除,从而降低了基因组的不稳定性,减少突变和癌变的发生;G2/M期阻滞则可保证细胞有丝分裂分配的忠实性。细胞在电离辐射照射下,细胞周期检测点激活使细胞阻滞于某一周期从而获得损伤修复的机会,经过损伤修复后的细胞可避免凋亡,再次进入正常的增殖周期,未能修复的细胞则走向凋亡。本实验采用体外培养的人食管癌细胞株EC-9706系作为研究对象,标本生物性能稳定,恶性程度高,增殖迅速,易于培养,是研究人食管癌放射生物学特性的理想细胞系。利用直线加速器6MV-X射线进行照射,以流式细胞仪测定照射后细胞周期分布,并分别通过流式细胞仪和凋亡试剂盒两种方法测定食管癌细胞X射线照射后凋亡情况,探讨X射线照射后食管癌细胞周期变化和凋亡的剂量效应关系、可能的机制以及与临床食管癌放射治疗实际应用的关系。材料与方法（1）标本:人食管癌细胞株EC-9706细胞系。（2）方法:取对数生长期人食管癌细胞株EC-9706,0.25%胰酶消化后离心,制成单细胞悬液,分别均匀接种于90个Corning培养皿,各设0Gy、2Gy、5Gy、10Gy、15Gy共五个剂量观察点,其中0Gy为对照组,其余为试验组。每皿接种1000个细胞,每剂量点设3个平行样本。培养皿置于6MV-X的SIEMENS医用电子直线加速器治疗床上,机头旋转180°射线从下方入射,剂量率200cGy/min,射野大小22cm×15cm,源皮距SSD为100cm。通过流式细胞仪（FCM）DNA含量检测,以0Gy组作为对照组,在不同的时间观察点即照射后6h,24h和48h分别检测其细胞周期的分布情况;不同剂量对食管癌株EC-9706细胞凋亡的诱导;通过凋亡试剂盒法重复以上实验,比较凋亡试剂盒法和FCM法检测不同剂量下,在不同时间观测点上对人食管癌细胞生长的影响,在此基础之上,比较两者的应用价值;准确标记样本并详细记录实验结果,分析现行的几种放疗模式的机理,提供可行性建议。结果:1.X线照射可以诱导人食管癌细胞株EC9706凋亡和改变细胞周期进程。不同照射剂量的X线作用于人食管癌细胞株EC-9706细胞后,在每个观察点上都可以发现,随着剂量加大,G2/M期阻滞比例增加,但在2Gy以下变化不明显,10Gy达到一个阻滞高峰,之后变为平缓增加;同时还发现2Gy之前,各组情况接近,受时间剂量影响很小,以后各个剂量组都在24h达到阻滞高峰。24h观察点上G2/M期细胞明显积累,5Gy剂量点分别达到48h和6h时的273%和1084%,10Gy剂量点分别达到48h和6h时的175%和728%。15Gy剂量点分别达到48h和6h时的160%和313%。2.X线照射可以诱导人食管癌细胞株EC9706细胞周期进程,主要表现在G2/M期阻滞和S期延迟。其中G2/M期阻滞在6h观察点时,15Gy与其他各剂量之间有差异,而0Gy、5Gy、2Gy、10Gy之间无统计学差异;24h观察点10Gy与15Gy之间无统计学差异,其他各剂量之间均有统计学差异;48h观察点0Gy、2Gy与5Gy剂量之间无统计学差异,10Gy与15Gy之间无差异。而10Gy、15Gy与0Gy、2Gy、5Gy之间有统计学差异。从时间比较,6h与24h之间有统计学差异,而6h与48h,24h与48h之间无统计学差异。S期延迟在6h与48h之间,24h与48h之间有统计学差异,而6h与24h之间无统计学差异。不同时间点的检测结果表明,随着照射剂量的增加,食管癌细胞从以G2/M期阻滞为主逐渐转化为以S期阻滞为主。3.X线照射诱导人食管癌细胞株EC-9706细胞S期延迟和G2/M期阻滞在0Gy～15Gy范围内有剂量依赖性,在24h时出现高峰。4.各照射后剂量点上,照射后6h细胞凋亡发生比例较高,说明照射后很快就发生细胞凋亡,以后随时间推移,凋亡比例下移,48h达到实验组最低,说明细胞启动修复机制,经过时间越长,肿瘤细胞越是得到较好修复。同时随着照射剂量的增加细胞凋亡也明显增加。凋亡试剂盒法变化趋势平缓,没有呈现较大起伏,从数据表中也可以看出标准差变异情况。两种方法差异显著。结论1.X线照射可以诱导人食管癌细胞株EC-9706凋亡和改变细胞周期进程。2.X线照射诱导的人食管癌细胞株EC-9706细胞周期进程改变,主要表现在G2/M期阻滞和S期延迟。3.X线照射诱导人食管癌细胞株EC-9706细胞S期延迟和G2/M期阻滞在0Gy～15Gy范围内有剂量依赖性,在24h时出现高峰。4.在人食管癌细胞株EC-9706细胞凋亡的实验研究中,建议应用凋亡试剂盒法,流式细胞仪法仅作为参考指标。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 论文部分 食管癌细胞株EC9706照射后细胞周期和凋亡的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 综述部分 电离辐射对肿瘤细胞周期和凋亡的影响
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录
• 致谢