不结球白菜NO3-的代谢生理及分子生物学

2020-11-28阅读(653)

论文摘要

硝酸盐是植物生长所需氮素营养的重要来源,尤其对于喜硝态氮的叶菜类蔬菜.研究蔬菜的硝酸盐代谢途径对于合理施用氮肥,提高蔬菜的产量与品质,优化无公害蔬菜生产具有十分重要的作用。本文以不结球白菜品种’苏州青’为供试材料,研究了不同硝态氮水平对其产量、主要营养品质及硝酸盐含量的影响;同时对硝酸盐诱导的氮代谢过程中的关键酶基因进行了克隆和序列分析;对硝酸盐代谢途径的限速酶硝酸还原酶基因进行了初步的功能鉴定;并对各基因在氮素处理下的表达特征进行了分析。主要研究结果如下:1.不同硝态氮水平对不结球白菜产量与主要营养品质及硝酸盐含量的影响以对硝酸盐诱导较敏感的不结球白菜品种’苏州青’作为供试材料,采用无土栽培法,研究营养液中不同浓度的硝态氮(0、4、8、12、16、20 mmol·L-1)对植株产量、主要营养品质及硝酸盐含量的影响,为不结球白菜生产及施肥提供理论依据。结果表明:地上部产量随着NO3--N的增加而增加,但是20mmol·L-1时植株的生长量反而有所下降;可溶性糖含量与维生素C含量变化趋势相同,除0mmol·L-1处理外,二者与供氮水平呈负相关;而可溶性蛋白含量在16mmol·L-1处理中达到最大,20mmol·L-1处理中略有下降。处理后不同器官的硝酸盐浓度也有所不同,叶柄中的硝酸盐含量明显高于叶片和根系;硝酸还原酶活性在叶片中最高,且与硝酸盐含量无明显相关。综上所述:硝态氮浓度为12mmol·L-1时,不结球白菜具有高产量,低硝酸盐含量且可溶性糖、蛋白、维生素C含量也都处于较高水平。2.不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在大肠杆菌中的表达以不结球白菜品种’苏州青’叶片cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术,获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因（NR）cDNA全序列3049bp,包含有2733bp的开放阅读框,编码910个氨基酸,命名为BcNR。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白结构域分析表明:所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。Southern杂交表明该基因在不结球白菜中至少有三个拷贝.该基因在GenBank中登录号为EU662272.扩增BcNR完整的编码区序列,构建pET-BcNR重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在103kDa处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。3.不结球白菜BcNR基因的功能分析本章对不结球白菜BcNR的功能进行了研究。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生型拟南芥中,经卡那霉素筛选,获得了抗性基因植株,经GUS基因PCR检测证明抗性植株中整合了BcNR基因,并用Real-time PCR方法对30mmol·L-1KNO3溶液处理的转基因拟南芥T0代的硝酸还原酶基因表达进行了检测,并测定了它们的硝酸还原酶活性.结果表明:转基因拟南芥经硝酸盐处理后,其硝酸还原酶基因的表达相对野生型有显著的提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高.4.不结球白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及序列分析以不结球白菜品种’苏州青’叶片cDNA为模板,采用RT-PCR、3’RACE和5’RACE技术,获得了编码亚硝酸还原酶基因（NiR）的cDNA全序列1852bp,包含有1749bp的开放阅读框,编码583个氨基酸,命名为BcNiR。其氨基酸序列与拟南芥NiR1、烟草nii2编码的氨基酸序列具有较高同源性,分别为83%和76%.所推导的氨基酸序列具有完整的NiR结构,含血红素蛋白β-化合物区域,一个明显的siroheme结合位点和4Fe-4S区域,可以在SWiSS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构.该基因在GenBank中登录号为EU499384.5.不结球白莱细胞质型谷氨酰胺合成酶基因BcGS1的克隆及其亚细胞定位以不结球白菜品种’苏州青’根系cDNA为模板,采用RT-PCR、3’RACE和5’RACE技术,获得了编码不结球白菜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因（GS1）的cDNA全序列1413bp,包含有1071bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,命名为BcGS1.其氨基酸序列与芜菁、甘蓝型油菜、拟南芥、菠菜等编码的氨基酸序列具有很高的同源性.该基因在GenBank中登录号为EU499383.扩增BcGS1 cDNA完整的编码区序列,构建了pBI-BcGS-GFP瞬时表达载体,采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,荧光观察发现BcGS-GFP定位于洋葱表皮细胞质内.6.不结球白菜叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因BcGS2的克隆及其在大肠杆菌中的表达以不结球白菜品种’苏州青’叶片cDNA为模板,采用RT-PCR、3’RACE和5’RACE技术,获得了编码叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因（GS2）的cDNA全序列1497bp,包含有1287bp的开放阅读框,编码428个氨基酸,命名为BcGS2.其氨基酸序列与甘蓝型油菜、拟南芥、菠菜、黄瓜等编码的氨基酸序列具有较高同源性。该基因在GenBank中登录号为EU239243。扩增BcGS2 cDNA完整的编码区序列,构建pET-BcGS2重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在49kDa处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。7.不结球白菜氮代谢关键酶在不同氮素条件下的表达分析采用实时定量PCR法分别对不结球白菜根系和叶片中的氮代谢关键酶基因（硝酸还原酶基因BcNR、亚硝酸还原酶基因BcNiR、细胞质型和叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因BcGS1和BcGS2）进行mRNA的表达检测,观察不同氮源以及氮源不同浓度和时间对以上基因表达的影响。结果显示:硝态氮处理有利于四种基因的表达,30mmol·L-1的硝态氮处理可使根系和叶片中的BcNR与BcNiR的表达量达到最大,20mmol·L（-1）硝态氮处理可使BcGS1和BcGS2基因表达量达到最大.硝态氮诱导初期,四种基因的表达水平均显著提高,后期呈下降趋势。铵态氮可促进BcGS1和BcGS2基因的表达,但高水平的铵浓度抑制了BcNR与BcNiR的表达.

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章文献综述植物硝酸盐代谢研究进展

3^-同化的分子生物学基础'>1.NO₃^-同化的分子生物学基础

1.1 高等植物的NR基因

1.1 高等植物的NR基因

1.1.1 NR的结构和特性

1.1.2 NR基因结构

1.1.3 NR基因的表达调控

1.2 高等植物的NiR基因

4⁺同化分子生物学基础'>2.NH₄⁺同化分子生物学基础

2.1 GS基因

2.1.1 GS基因的结构组成

2.1.2 GS基因的表达调节

2.2 GOGAT基因

3.基因克隆方法研究进展

3.1 图位克隆

3.2 转座子标签法

3.3 功能基因克隆

3.4 差异显示基因克隆

3.4.1 差异展示反转录PCR（DDRT-PCR）

3.4.2 cDNA代表性差异分析（RDA）

3.4.3 抑制性扣除杂交技术（SSH）

3.5 同源基因克隆

3.5.1 文库筛选法

3.5.2 cDNA末端快速扩增

3.6 PCR法获得新基因的方法

3.6.1 重叠延伸PCR

3.6.2 连续延伸PCR法

3.6.3 基于PCR的两步PTDS方法

第二章不同硝态氮水平对不结球白菜产量与主要营养品质及硝酸盐含量的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.1.2.1 处理方法

2.1.2.2 采样及测定

2.2 结果与分析

3^--N水平对不结球白菜生长的影响'>2.2.1 不同NO₃^--N水平对不结球白菜生长的影响

3^--N水平对不结球白菜不同部位硝酸盐含量的影响'>2.2.2 不同NO₃^--N水平对不结球白菜不同部位硝酸盐含量的影响

3^--N水平对不结球白菜不同部位硝酸还原酶活性（NRA）的影响'>2.2.3 不同NO₃^--N水平对不结球白菜不同部位硝酸还原酶活性（NRA）的影响

3^--N水平对不结球白菜营养品质的影响'>2.2.4 不同NO₃^--N水平对不结球白菜营养品质的影响

2.3 讨论

3^--N水平与植物生长、硝酸盐积累的关系'>2.3.1 不同NO₃^--N水平与植物生长、硝酸盐积累的关系

3^--N水平与植物体内硝酸盐分布的关系'>2.3.2 不同NO₃^--N水平与植物体内硝酸盐分布的关系

2.3.3 叶片中硝酸盐积累与NRA的关系

3^--N水平与不结球白菜主要营养品质的关系'>2.3.4 不同NO₃^--N水平与不结球白菜主要营养品质的关系

第三章不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在大肠杆菌中的表达

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 植物材料

3.1.1.2 菌株与质粒

3.1.1.3 各种酶类

3.1.1.4 试剂盒

3.1.1.5 常用储液

3.1.2 方法

3.1.2.1 材料的准备

3.1.2.2 总RNA的提取（Trizol法）

3.1.2.3 去除总RNA中痕量DNA污染

3.1.2.4 sscDNA的合成

3.1.2.5 引物的设计

3.1.2.6 不结球白菜BcNR基因的扩增

3.1.2.7 3'RACE

3.1.2.8 5'RACE

3.1.2.9 目的片段的回收、克隆

3.1.2.10 序列测定及分析

3.1.2.11 Southern杂交

3.1.2.12 不结球白菜BcNR基因的原核表达

3.2 结果与分析

3.2.1 BcNR特异片段、5'RACE和3'RACE扩增

3.2.3 推测的氨基酸序列分析

3.2.4 不结球白菜BcNR二级结构和三级结构的分析

3.2.5 不结球白菜BcNR基因的拷贝数验证

3.2.6 不结球白菜BcNR基因在大肠杆菌中的表达

3.3 讨论

第四章不结球白菜BcNR基因的功能分析

4.1 材料与方法

4.1.1 不结球白菜材料和菌株

4.1.2 酶和化学试剂

4.1.3 植物过量表达载体pCAM-BcNR的构建

4.1.4 农杆菌介导法对拟南芥的转化

4.1.5 转基因拟南芥的抗性筛选

4.1.6 GUS基因活性检测（组织化学染色法）

4.1.7 转基因拟南芥的GUS-PCR检测

4.1.8 转基因拟南芥NR基因的real-time PCR分析

4.1.9转基因拟南芥NRA测定

4.2 结果与分析

4.2.1 植物表达载体pCAM-BcNR的构建

4.2.2 转基因阳性植株的抗性筛选和GUS检测

4.2.3 转基因植株NR基因的real-time PCR分析

4.2.4 转基因植株NRA测定

4.3 讨论

第五章不结球白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及序列分析

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.1.1 植物材料

5.1.1.2 菌株与质粒

5.1.1.3 各种酶类

5.1.1.4 试剂盒

5.1.1.5 常用储液

5.1.2 方法

5.1.2.1 材料的准备

5.1.2.2 总RNA的提取

5.1.2.3 sscDNA的合成

5.1.2.4 引物的设计

5.1.2.5 不结球白菜BcNiR基因的扩增

5.1.2.6 序列测定及分析

5.2 结果与分析

5.2.1 不结球白菜BcNiR基因cDNA全长的克隆

5.2.2 不结球白菜BcNiR基因cDNA全长的拼接及序列分析

5.2.3 推测的氨基酸序列分析

5.2.4 不结球白菜BcNiR的二级结构和三维结构分析

5.3 讨论

第六章不结球白菜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因BcGS1的克隆及其亚细胞定位

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.1.1 植物材料

6.1.1.2 菌株与质粒

6.1.1.3 各种酶类

6.1.1.4 试剂盒

6.1.1.5 常用储液

6.1.2 方法

6.1.2.1 材料的准备

6.1.2.2 总RNA的提取

6.1.2.3 sscDNA的合成

6.1.2.4 引物的设计

6.1.2.5 不结球白菜BcGS1基因的扩增

6.1.2.6 序列测定及分析

6.1.2.7 不结球白菜BcGS1基因的亚细胞定位

6.2 结果与分析

6.2.1 不结球白菜BcGSI基因cDNA全长的克隆

6.2.1.1 不结球白菜BEGSl基因eDNA中间片段RT-PCR的扩增

6.2.1.2 3'RACE

6.2.1.3 5'RACE

6.2.2 不结球白菜BcGS1基因cDNA全长的拼接及序列分析

6.2.3 推测的氨基酸序列分析

6.2.4 不结球白菜BcGS1的二级结构和三级结构的分析

6.2.5 不结球白菜BEGSl基因的亚细胞定位

6.3 讨论

第七章不结球白菜叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因BcGS2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

7.1 材料与方法

7.1.1 材料

7.1.1.1 植物材料

7.1.1.2 菌株与质粒

7.1.1.3 各种酶类

7.1.1.4 试剂盒

7.1.1.5 常用储液

7.1.2 方法

7.1.2.1 材料的准备

7.1.2.2 总RNA的提取

7.1.2.3 sscDNA的合成

7.1.2.4 引物的设计

7.1.2.5 不结球白菜BcGS2基因的扩增

7.1.2.6 序列测定及分析

7.1.2.7 不结球白菜BcGS2基因的原核表达

7.2 结果与分析

7.2.1 BcGS2特异片段和3'RACE扩增

7.2.2 不结球白菜BcGS2基因cDNA全长的拼接及序列分析

7.2.3 推测的氨基酸序列分析

7.2.4 不结球白菜BcGS2的二级结构和三级结构的分析

7.2.5 不结球白菜BcGS2基因在大肠杆菌中的表达

7.3 讨论

第八章不结球白菜氮代谢关键酶在不同氮素条件下的表达分析

8.1 材料与方法

8.1.1 植物材料

8.1.2 方法

8.1.2.1 处理方法

8.1.2.2 RNA提取和鉴定

8.1.2.3 去除痕量DNA污染

8.1.2.4 sscDNA的合成

8.1.2.5 引物的设计

8.1.2.6 实时定量PCR反应

8.2 结果与分析

8.2.1 不同氮素条件对BcNR基因表达的影响

8.2.2 不同氮素条件对BcNiR基因表达的影响

8.2.3 不同氮素条件对对根系中BcGS1基因表达的影响

8.2.4 不同氮素条件对叶片中BcGS2基因表达的影响

8.3 讨论

全文结论及创新点

全文结论

本文创新点

主要参考文献

致谢

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不结球白菜NO3-的代谢生理及分子生物学

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