论文摘要
恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病，基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光，国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。但十多年来基因治疗的实验和临床研究结果表明，肿瘤基因治疗远没有达到人们当初期望的那样有效。自杀基因治疗虽然存在旁杀伤机制，理论上能完全消除肿瘤细胞达到治愈的效果，但由于目前载体转染效率较低，靶向性不足，因此对肿瘤细胞的杀伤效率不够高，而且因病毒载体的使用等带来了一定毒副作用。如何提高治疗效果，减低其毒副作用是目前仍需解决的关键问题。现有研究发现，几乎所有自杀伤基因系统都存在旁杀伤效应，增强旁杀伤效应能降低对高转染率的要求，减少载体及前体药物用量和毒性，增强基因治疗系统对肿瘤杀伤力。因此，增强旁杀伤效应已成为提高肿瘤基因治疗疗效的重要策略。产生旁杀伤效应的主要机制有：凋亡介导，缝隙连接细胞通讯介导和免疫介导等。根据上述几种机制，目前形成旁杀伤效应的增效策略主要有：诱导癌细胞凋亡、促进GJIC和提高患瘤机体的免疫力等等。常用的技术手段包括基因转染法及药物诱导法。中药是一个天然药物宝库，在促进诱导癌细胞凋亡、肿瘤GJIC或提高患瘤机体免疫功能等方面都有优势或潜力，且毒副作用相对较少，从中寻找自杀基因增效药物，建立中西医结合疗法具有可行性和良好的应用前景。研究目的：本课题选择有诱导癌细胞凋亡作用或可能有促进GJIC的抑癌中药成分木犀草素、黄芩苷和大黄素，研究其对自杀基因系统是否有协同增效作用，获得肯定作用的中药成分，探讨其通过细胞凋亡机制或GJIC增强自杀基因旁杀伤效应的药理靶点，阐明其增效的机理，为建立肿瘤基因治疗联合中医药疗法，推进肿瘤基因治疗的临床应用和抗癌中药新药开发打下基础。实验方法：本文以体外培养的大鼠肝癌CBRH7919细胞作为研究对象，药效实验设tk-对照组、GCV组、中药组、中药+GCV组、10％tk+对照组、10％tk+／GCV组、中药联合10％tk+／GCV组。首先采用MTT法从木犀草素、黄芩苷和大黄素中筛选对自杀伤基因有协同作用的中药活性成分，用金正均Q值作为评价标准：Q为实际联合药效与理论联合药效的比值，Q＜0.85为拮抗作用，0.85≤Q＜1.15为相加作用，Q≥1.15为协同作用；然后以流式细胞技术检测有协同作用的中药成分对癌细胞凋亡指数及细胞周期的影响；甲基绿-派诺宁染色和丫啶橙染色观察凋亡细胞形态；琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡DNA条带；SL／DT法观察其对CBRH7919的GJIC功能的影响；western-blot法检测其对缝隙连接蛋白Cx43和Cx32表达的影响。结果：1中药活性成分对自杀基因旁观者效应的体外筛选结果单纯木犀草素在5μM与10μM浓度下的抑制率分别为13.8±2.95％与28.93±5.49％，IC50为26uM即8.58ug／mL。木犀草素在5μM与10μM浓度下联合10％tk+／GCV组的实际抑制率分别为42.33±4.89％、48.79±6.89％，联合组抑制率明显高于单独木犀草素组和10％tk+／GCV组，也高于联合作用的理论抑制率，金正钧Q值分别为1.459和1.176，均大于1.15，说明是协同作用；在木犀草素20μM和40μM的浓度下，联合组的抑制率虽然高于单独木犀草素组和10％tk+／GCV组，但是金正钧Q值均在0.85与1.15之间，说明是相加作用。黄芩苷与大黄素各浓度作用下，联合10％tk+／GCV的金正钧Q值均在0.85与1.15之间，是相加作用。2木犀草素对大鼠肝癌细胞CBRH7919杀伤作用的凋亡机制探讨结果（1）流式细胞分析显示，木犀草素与HSV-TK／GCV治疗系统联用，可显著提高大鼠肝癌细胞凋亡率，并使细胞较多的停滞于S期，单独木犀草素对凋亡率提高不显著，对大鼠肝癌细胞周期也无明显影响。（2）甲基绿-派诺宁染色和丫啶橙染色均核膜不光滑平整、核皱缩或碎裂，细胞质出现较多空泡等典型细胞的凋亡形态，表明木犀草素对CBRH7919有诱导凋亡的作用。（3）琼脂糖凝胶结果是出现有规律的DNA条带，而不是涂布状条带，也说明木犀草素对CBRH7919作用是诱导凋亡。3木犀草素对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接及相关蛋白表达影响的结果（1） SL／DT法显示，经木犀草素处理32小时后的，荧光染料不仅出现在划痕的附近细胞内，而且在划痕以外的3-4列细胞内也出现了荧光（++++），划痕两边被染色的细胞明显增多，出现了明显的细胞间染料传输的现象，说明细胞的缝隙连接通讯功能获得增强。（2） western-blot表明，木犀草素作用组比对照组的蛋白电泳条带要宽，颜色要深，而且木犀草素作用48h的蛋白电泳条带比其作用24h又要宽，颜色要深。这说明木犀草素能提高CBRH7919缝隙连接蛋白Cx43和Cx32的表达，且与药物作用时间呈正比。结论：本文在细胞水平实验探讨了中药活性成分木犀草素、黄芩苷和大黄素对HSV-TK／GCV自杀基因疗法的增效作用，发现木犀草素能有效提高自杀基因对肿瘤细胞的抑制率，提高旁观者效应，而且有协同增效作用，然黄芩苷和大黄素与10％tk+／GCV联合则未显示有协同增效作用。其机制研究结果表明，很可能是通过增强CBRH7919细胞的GJIC或诱导凋亡，调节细胞周期等来起作用，也可能是几个机制同时起作用。