固定化酶法合成氨基葡萄糖-6-磷酸的研究

论文摘要

氨基葡萄糖-6-磷酸酯的生产制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。酶法合成方面,早期以6-磷酸果糖、谷氨酰胺及三磷酸腺苷为原料在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶催化下合成,另一种酶促转化法以氨基葡萄糖与ATP为原料,在已糖激酶作用下直接合成氨基葡萄糖-6-磷酸,由于酶源来源方便,三磷酸腺苷价格下降,副产物ADP回收利用及固定化酶的使用,该法工业化的可能性加大。本实验从土壤中分离筛选得到一株氨基葡萄糖激酶高产菌,并进行了培养基与培养条件的优化。在培养基优化过程中,着重考察了培养基中的碳源：氨基葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖；氮源：玉米浆、牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、硫酸铵；无机离子：CaCl2·2H20、 MgS04·7H2O、FeS04·7H2O、CuSO4·5H2O、MnS04-5H20对酶发酵的影响。选择确定最佳碳源为氨基葡萄糖,最佳氮源为玉米浆,最佳无机盐为MgCl2-12H20。经正交实验确定最佳培养基组成为：氨基葡萄糖3%、玉米浆0.5%、MgCl2·12H200.03%;最佳发酵条件为：搅拌转速600rpm,发酵温度为30℃,通气量为5L/min,接种量为2%酶活力产量达到了145U/ml发酵液（以氨基葡萄糖为底物计）。本实验还考察了细胞破碎的三种方法,其中以SDS（十二烷基硫酸钠）法最好,最佳节条件为SDS浓度为为0.1%,EDTA浓度为3mmo1/L提取时间4小时,经超滤和DEAE纤维素层析后可纯化430倍,该酶,在5%葡萄糖存在条件经聚丙烯酰胺固定化,酶活力回收率可达45%,该固定化酶重复使用10次后酶活力仍保留50%。在酶促合成氨基葡萄糖-6-磷酸过程中,考察了反应温度及三种反应物的浓度对反应收率的影响,最佳条件为氨基葡萄糖2mmol, ATP1.8mmol,MgCl21.5mmol转化率最高可达90%,纯度98%以上,同时副产物中没有ATP,有利于ADP的进一步分离纯化回收利用,降低生产成本。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 糖生物学发展现状
• 1.2 寡糖的合成
• 1.3 酶促寡糖合成
• 1.4 寡糖合成现状及发展方向
• 1.5 糖基磷酸脂的功能与合成
• 1.6 课题研究依据及设计方案
• 1.7 论文的研究目的和意义
• 第二章 产氨基葡萄糖激酶的微生物筛选与发酵条件优化
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 土样
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 土壤细菌的初筛
• 2.2.2 产酶菌复筛
• 2.2.3 种子生长曲线测定
• 2.2.4 种子培养
• 2.2.5 发酵培养
• 2.2.6 HPLC测定氨基葡萄糖激酶活性
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 初筛复筛结果
• 2.3.2 种子生长曲线
• 2.3.3 酶反应体系HPLC色谱图
• 2.3.4 氨基葡萄糖标准曲线
• 2.3.5 发酵培养基组成对发酵液中氨基葡萄糖激酶酶活力的影响
• 2.3.6 培养基优化的正交试验结果
• 2.3.7 发酵温度对细菌生长及酶活力的影响
• 2.3.8 发酵pH对细菌产酶的影响
• 2.3.9 发酵接种量对细菌产酶的影响
• 2.3.10 5L发酵罐正交实验结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 氨基葡萄糖激酶提取与分离纯化
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 仪器药品
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 蛋白质测定——考马斯亮兰染色法（Bradford法）标准曲线
• 3.2.2 三种提取方法比较
• 3.2.3 SDS提取正交实验结果
• 3.2.4 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.5 提取分离纯化各步酶的SDS电泳结果
• 3.2.6 SDS提取法回收率表
• 3.3 本章小结
• 第四章 酶的固定化及性质测定
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 试验原料及试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 测定方法与计算
• 4.2.2 聚丙烯酰胺固定化方法
• 4.2.3 明胶固定化方法
• 4.2.4 卡拉胶固定化方法
• 4.2.5 固定化酶的酶学特性的研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 聚丙烯酰胺固定化条件优化
• 4.3.2 明胶固定化条件优化
• 4.3.3 卡拉胶固定化条件优化
• 4.3.4 酶学特性
• 4.4 本章小结
• 第五章 氨基葡萄糖-6-磷酸的合成与鉴定
• 5.1 实验材料与设备
• 5.1.1 主要仪器及设备
• 5.1.2 主要试剂与药品
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 酶促反应
• 5.2.2 酶促反应条件优化
• 5.2.3 产物分离纯化
• 5.2.4 产物HPLC分析
• 5.2.5 红外光谱分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 氯化镁加量对酶促反应的影响
• 5.3.2 反应温度对酶促反应的影响
• 5.3.3 氨基葡萄糖加量对酶促反应的影响
• 5.3.4 产物液相色谱标准曲线
• 5.3.5 产品液相谱测定结果
• 5.3.6 产品红外光谱图
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢