阻断离子通道影响人喉鳞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及RNA编辑酶ADAR1表达的体内外实验研究

论文摘要

喉癌发生发展机制复杂,至今未完全明了。细胞恶性变与细胞信号传导的过程紧密相关,信号传导的异常在恶性肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色,而细胞信号传导与多种因素如蛋白质代谢、离子通道功能状态等密切相关。首先,细胞信号传导过程中伴随着大量的蛋白质代谢,而蛋白质代谢与RNA编辑密切相关。RNA编辑是转录后mRNA和tRNA碱基变化的现象,是一种对基因编码的mRNA进行重新修饰的过程,RNA编辑改变可使得RNA所携带的遗传信息发生改变,导致最终的蛋白序列、结构和功能的变化。对RNA发生编辑作用的酶称为RNA编辑酶,在从原虫到哺乳动物的体内广泛存在,近来越来越多的研究表明RNA编辑酶的异常与肿瘤发生发展密切相关。其次,细胞信号传导过程中伴随着细胞膜离子通道功能状态的改变。钾离子通道广泛分布在生物细胞中,其中延迟整流钾通道属于电压门控钾离子通道,除在可兴奋细胞起决定动作电位的复极相及维持不应期的作用外,还与肿瘤细胞的恶性增殖有关。氯离子是生物体内最多的阴离子,在维持静息膜电位,调节细胞内钙、pH值、细胞增生和分化中起着重要的作用,研究表明氯离子通道和细胞增殖及凋亡密切相关。钙离子通道是一种极为常见的信号传递通路,钙离子通道的变化可影响肿瘤细胞的生长,其阻滞剂能通过抑制钙离子的内流与释放影响肿瘤细胞的生长增殖。为探讨喉癌发生发展与离子通道、RNA编辑酶ADAR1表达的关系,本研究在体外培养Hep-2细胞的基础上,采用穿孔膜片钳全细胞记录法、MTT比色法、结晶紫比色法、流式细胞术、TUNEL染色法、Western blot及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等方法观察Hep-2细胞离子通道特性、喉癌组织RNA编辑酶ADAR1的表达、阻断离子通道对Hep-2细胞增殖、凋亡、ERK1/2、AKT1蛋白磷酸化水平及RNA编辑酶ADAR1表达的影响及其相关性。为进一步明确离子通道阻断剂在体内代谢后对肿瘤的影响,本研究以Hep-2细胞株建立移植瘤模型,应用不同浓度的氯离子通道阻断剂（NPPB）分组进行治疗实验,观察NPPB的抑瘤作用,并探讨其可能机制。本研究分为以下三部分:第一部分Hep-2细胞离子通道特性及喉癌组织RNA编辑酶ADAR1的表达方法1.采用穿孔膜片钳全细胞记录法研究人喉鳞癌Hep-2细胞钾离子、氯离子及钙离子通道特性;2.采用半定量逆转录-聚合酶链反应检测人喉鳞癌Hep-2细胞、喉癌组织、癌旁组织及其他喉疾病组织RNA编辑酶ADAR1 mRNA的表达;3.统计学处理:以SPSS13.0统计软件作统计学处理,RT-PCR结果采用均数±标准差（（?）±s）的形式表示,进行t检验及方差分析,P＜0.05表示有统计学意义。结果1.Hep-2细胞膜的静息膜电位为（-29.8±1.9）mV,Hep-2细胞膜钾离子电流具有电压依赖性、外向整流特性的特点,可被四乙胺（TEA）阻断;2.Hep-2细胞单通道氯电流具有明显容积敏感性、外向整流特性及电压依赖性,可被5-硝基-2-（3苯丙氨基）苯甲酸（NPPB）阻断;3.在阻断Hep-2细胞膜上钠、钾电流后,钳制电压为-90 mV时,Hep-2细胞膜上可连续记录到钙离子电流,以10 mV为阶跃电压去极化,在-60 mV获得钙离子通道的反转电流,属于低电压激活钙通道,可被尼莫地平（ND）阻断;4.喉癌及其癌旁组织ADAR1 mRNA均有表达,两者相对表达量间存在显著性差异（P＜0.001）;不同临床分期组、不同病理分级组、有无淋巴结转移组组间比较,差异均无统计学意义（P均＞0.05）;5.Hep-2细胞ADAR1 mRNA有表达,相对表达量为2.852±0.735,显著高于对照之正常喉粘膜组织（P＜0.05）。第二部分阻断离子通道对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖、凋亡、ERK1/2、AKT1蛋白磷酸化及RNA编辑酶ADAR1表达的影响方法1.采用MTT比色法及结晶紫比色法测定阻断钾、氯及钙离子通道对Hep-2细胞增殖及生长的影响;2.采用TUNEL染色法检测阻断离子通道对Hep-2细胞凋亡的影响;3.采用流式细胞术测定阻断离子通道前后Hep-2细胞凋亡率及细胞周期分布的变化;4.采用Western blot检测阻断离子通道前后Hep-2细胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平变化情况;5.采用逆转录-聚合酶链反应检测阻断离子通道对Hep-2细胞RNA编辑酶ADAR1mRNA表达的影响;6.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件作统计学处理,结果采用方差分析加LSD法两两比较,相关性用spearman相关性分析,P＜0.05表示有统计学意义。结果1.与对照组比较,5、10、15、20mM TEA明显抑制Hep-2细胞增殖、诱导凋亡,具有明显的时间和剂量依赖性,对Hep-2细胞的G0/G1期有阻滞作用;2.与对照组比较,50、100、150 NPPB浓度依赖性地抑制了Hep-2细胞增殖,作用12h后均可诱导Hep-2细胞凋亡,作用后G0/G1期细胞比例较作用前明显增加,S期细胞比例较作用前明显减少,具有时间依赖性;3.5、10、50、100μM ND量-效依赖性地抑制Hep-2细胞增殖,作用12h时G0/G1期前可见亚二倍体凋亡峰,24、48h亚二倍体峰逐渐增高,随作用时间的延长,凋亡率逐渐增加,作用后G0/G1期细胞比例较作用前明显增加,S期细胞比例较作用前明显减少;4.阻断钾、氯、钙离子通道没有明显改变Hep-2细胞ERK1/2和AKT1总蛋白水平,但显著降低了Hep-2细胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平;5.TEA（5、10、15、20mM）阻断Hep-2细胞钾通道、NPPB（50、100、150μM）阻断氯通道、ND（5、10、50、100μM）阻断钙通道30min、1h、2h后ADAR1 mRNA相对表达量降低,与阻断前比较存在显著性差异,具有时间浓度依赖性;6.阻断钾、氯、钙离子通道抑制Hep-2细胞增殖与ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的降低、RNA编辑酶ADAR1mRNA相对表达量的下调密切相关。第三部分氯离子通道阻滞剂NPPB对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用方法1.以Hep-2细胞建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型,待成瘤后分为5组,对照组注射PBS,治疗组分别注射10、50、100、150μM NPPB;2.定期测定裸小鼠体质量及移植瘤体积用以绘制移植瘤生长变化的曲线及评价NPPB毒性。治疗结束后称重剥除之移植瘤,计算NPPB抑瘤率;3.以TUNEL法测定移植瘤细胞凋亡的情况及其细胞凋亡指数;4.应用Western blot检测移植瘤ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平;5.以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测经NPPB阻断氯离子通道后移植瘤ADAR1mRNA表达情况;6.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件作统计学处理,采用t检验,P＜0.05表示有统计学意义。结果1.与对照组比较,实验组（50、100、150μM NPPB组）肿瘤生长较慢,肿瘤体积小于对照组,且随治疗时间延长,这种抑制效果更加明显,治疗结束时,实验组（50、100、150μM NPPB）瘤体积减小（P均＜0.05）、瘤质量降低（P均＜0.01）;2.实验组（50、100、150μM NPPB组）肿瘤组织中凋亡细胞数明显增多,与对照组比较,均有显著性差异（P均＜0.05）;3.实验组ERK1/2和AKT1总蛋白水平与对照组比较无显著性差别（P均＞0.05）。与对照组比较,实验组（50、100、150μM NPPB组）ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平降低（P均＜0.05）;4.与对照组比较,实验组（50、100、150μM NPPB组）RNA编辑酶ADAR1mRNA相对表达量降低（P均＜0.05）;5.治疗过程中,裸鼠未见明显不良反应,各组末体质量/初体质量均＞0.8,表明各实验组无毒性反应。结论本文采用穿孔膜片钳全细胞记录法、MTT比色法、结晶紫比色法、流式细胞术、TUNEL染色法、Western blot及逆转录-聚合酶链反应等方法观察了Hep-2细胞离子通道特性、喉癌组织RNA编辑酶ADAR1 mRNA的表达、阻断离子通道对Hep-2细胞增殖、凋亡、ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平及RNA编辑酶ADAR1 mRNA的影响,并探讨了体内阻断氯通道对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其可能机制,得出如下结论:1.Hep-2细胞具有电压依赖、外向整流特性的钾离子通道及容积敏感性、外向整流特性及电压依赖性的氯离子通道,具有低电压激活的钙离子通道,即T-型钙通道;2.Hep-2细胞、喉癌及其喉旁组织ADAR1 mRNA均有表达,RNA编辑酶ADAR1与喉癌的发生有关,但与临床分期、病理分级及有无淋巴结转移无关;3.阻断钾、氯、钙通道可抑制Hep-2细胞增殖和诱导凋亡,使细胞阻滞于G0/G1期,阻断离子通道抑制Hep-2细胞增殖和诱导凋亡可能是通过改变细胞周期而实现的,呈时间剂量依赖关系;4.阻断钾、氯、钙通道可浓度依赖性地下调Hep-2细胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的表达,ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的降低与离子通道阻断剂抑制Hep-2细胞增殖密切相关;5.阻断钾、氯、钙通道浓度依赖性下调Hep-2细胞RNA编辑酶ADAR1mRNA的相对表达,RNA编辑酶ADAR1mRNA相对表达量与离子通道阻断剂抑制Hep-2细胞增殖密切相关;6.成功构建了人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,证实NPPB（50、100和150μM）能抑制喉癌移植瘤生长,对机体无明显毒副作用;7.与体外实验结果相似,阻断氯通道下调喉癌裸鼠移植瘤ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的表达;同时下调RNA编辑酶ADAR1 mRNA表达;体内证实了阻断氯通道对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用,其机制可能与下调ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平及RNA编辑酶ADAR1 mRNA表达密切相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 阻断离子通道影响人喉鳞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及其RNA编辑酶ADAR1表达的体内外实验研究
• 引言
• 第一部分 Hep-2细胞离子通道的特性及喉癌组织RNA编辑酶ADAR1的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附照片
• 第二部分 阻断离子通道对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖、凋亡、ERK1/2、AKT1蛋白磷酸化及RNA编辑酶ADAR1表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附照片
• 第三部分 氯离子通道阻断剂NPPB对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附照片
• 结论
• 参考文献
• 综述部分 肿瘤离子通道的研究进展
• 参考文献
• 附录1 英文缩略词
• 附录2 博士研究生期间发表的论文
• 致谢