产乙醇菌株的选育及木糖代谢关键酶基因的克隆

论文摘要

生物乙醇作为一种清洁可再生能源,被纳入许多国家的能源发展规划。廉价的原料和高效转化工艺是燃料乙醇商业化生产的必要条件,利用可再生植物纤维资源生物转化制取乙醇的研究成为当前的热点,尤其是利用纤维素生产燃料乙醇,而纤维素糖化液的高效转化和木糖转化成乙醇是关键因素之一。其中木糖的高效乙醇发酵是该技术工业化的基础和制约因素。寻求性能优良的木糖发酵菌株和研究微生物木糖代谢工程成为当前研发的重点。本研究从酒曲和牛粪样品中分别筛选到一个发酵蔗渣糖化液产乙醇的菌株和一个发酵木糖产乙醇的菌株。经形态学分析、理化特性鉴定和分子生物学鉴定,确定这两个菌株分别属于酿酒酵母属（命名为Saccharomyces cerevisiae Q2-1）和热带假丝酵母属（命名为Candida tropicalis H-1）。对S.cerevisiae Q2-1发酵蔗渣糖化液产乙醇的条件进行研究。通过对发酵条件的优化,该菌株在起始pH值为5.5,温度为30℃的条件下,利用含有0.4%硫酸铵的发酵培养基静置发酵60h,发酵率可以达到89.18%,1g蔗渣可以转化成0.136g乙醇。提取Candida tropicalis H-1总DNA,设计引物,通过基因克隆,从C.tropicalisH-1的总DNA上克隆到木糖还原酶基因（xyl1）和木糖醇脱氢酶基因（xyl2）,分析这两个基因的序列,没有内含子。将基因xyl1和xyl2插入pPIC3.5K,构建了整合载体pPIC3.5K-xyl1-xyl2,电转化至Pichia stipitis GS115中。xyl1和xyl2通过同源臂交换整合至GS115染色体上,通过菌落PCR筛选,获得了重组子GS115-xyl1-xyl2。木糖还原酶（XR）是NAD（P）H依赖性氧化还原酶,以NADPH或NADH为辅酶,木糖醇脱氢酶（XDH）以NAD+为专一辅酶。用甲醇诱导重组子表达,通过细胞破碎,收集粗酶液。测得粗酶液中XR和XDH的相对酶活分别为12.3U和1.1U,重组蛋白XR对辅酶NADPH的依赖性要比对辅酶NADH的依赖性大,表明该酶可能为NADPH的依赖型。蛋白酶XDH的活性相对比较高,达到2232.9U。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 燃料乙醇的研究背景
• 1.1.1 燃料乙醇生产的概况
• 1.1.2 自然界中纤维素生物质及其利用
• 1.2 自然界发酵产乙醇的微生物
• 1.3 微生物的木糖代谢
• 1.3.1 微生物的木糖代谢途径
• 1.3.2 利用木糖酿酒酵母代谢工程
• 1.3.3 发酵木糖产乙醇的其它工程菌
• 1.4 木糖还原酶与木糖醇脱氢酶
• 1.4.1 木糖还原酶的结构
• 1.4.2 木糖醇脱氢酶的结构
• 1.5 本研究的目的和主要内容
• 2 发酵甘蔗渣糖化液产乙醇酵母菌株的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 甘蔗渣糖化
• 2.1.3.2 酵母菌株分离
• 2.1.3.3 酵母菌株初筛与复筛
• 2.1.3.4 生长曲线测定
• 2.1.3.5 菌株鉴定
• 2.1.3.6 还原糖含量测定
• 2.1.3.7 乙醇含量测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 产乙醇菌株的筛选
• 2.2.2 利用甘蔗渣糖化液发酵条件分析
• 2.2.2.1 温度对发酵产乙醇的影响
• 2.2.2.2 氮源对发酵产乙醇的影响
• 2.2.2.3 起始pH值对发酵产乙醇的影响
• 2.2.2.4 影响菌株发酵产乙醇的其它因素
• 2.2.3 发酵条件优化
• 2.3 讨论
• 3 木糖代谢关键酶基因克隆与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 菌种与质粒
• 3.1.1.2 引物
• 3.1.1.3 主要试剂
• 3.1.1.4 常用培养基
• 3.1.1.5 常用溶液
• 3.1.1.6 主要仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 热带假丝酵母（C.tropicalis）总DNA提取
• 3.1.2.2 C.tropicalis木糖还原酶基因克隆
• 3.1.2.2.1 PCR扩增目的片段
• 3.1.2.2.2 T-A克隆及克隆子筛选
• 3.1.2.3 C.tropicalis木糖醇脱氢酶基因克隆
• 3.1.2.3.1 PCR扩增目的片段
• 3.1.2.3.2 T-A克隆及克隆子筛选
• 3.1.2.4 质粒构建
• 3.1.2.4.1 质粒pPIC3.5K-xyl1构建
• 3.1.2.4.2 质粒pPIC3.5K-xyl1-xyl2构建
• 3.1.2.5 质粒pPIC3.5K-xyl1-xyl2电转化
• 3.1.2.5.1 GS115感受态细胞制备
• 3.1.2.5.2 转化及转化子筛选
• 3.1.2.6 重组蛋白表达
• 3.1.2.6.1 甲醇诱导重组蛋白表达
• 3.1.2.6.2 重组蛋白酶活测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 C.tropicalis木糖还原酶基因与木糖醇脱氢酶基因克隆
• 3.2.2 质粒pPIC3.5K-xyl1构建
• 3.2.3 质粒pPIC3.5K-xyl1-xyl2构建
• 3.2.4 重组质粒转化
• 3.2.5 重组蛋白酶活性测定与分析
• 3.3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢