胆固醇氧化酶生产菌株筛选及鉴定

论文摘要

生物方法降解食品中的胆固醇一直被认为是目前最安全有效的方法之一。研究和利用胆固醇氧化酶以降低食品I和人体血清中的胆固醇已受到广泛关注。本文主要研究了从富含胆固醇的环境中筛选出胆固醇氧化酶产量较高的菌株,并对其进行菌种鉴定,对产酶能力突出的菌株进行了发酵条件的优化。本实验将腐败的蛋黄、猪油分别与花园中的土壤混合发酵一个月后的样品以及腐败的腊肠作为胆固醇氧化酶产生菌的来源,经富集培养和筛选性培养,通过比色法测定酶活进行产酶鉴定,得到产胆固醇氧化酶的菌株12株,同批次发酵培养进行产酶能力比较,得到两株产酶能力高的菌株。其中编号为F-2的菌株产酶量为1433.932 U/L,编号为SP04的菌株产酶量为1385.0987 U/L。对这两株菌进行生理生化和分子生物学的鉴定。编号F-2菌株通过生理生化初步鉴定为细菌,经细菌16S rDNA测序提交至NCBI获得序列号HQ537785,构建系统发育树后得出最终结论,该菌为绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）;编号SP04的菌株通过普通细菌破壁方法无法得到其基因组DNA,因此将经该菌株送至生物公司进行酵母菌26SrDNA测序,提交至NCBI获得序列号HQ537786,构建系统发育树并结合酵母菌生理生化实验综合鉴定后得出最终结论,该菌为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）。由于酵母菌产胆固醇氧化酶报道较少,且本实验中筛选出的酵母菌产酶活力较高,因此对酵母菌SP04进行发酵条件的优化。通过考查碳氮源,胆固醇、吐温-80的添加量以及pH、温度、装液量等的影响,正交实验优化后,得到的结论为：优化后的培养基组成为：玉米淀粉0.9%,酵母膏1.5%,胆固醇0.2%,吐温-801%;理想的发酵条件为：pH值为7.5,37℃条件下,装液量为75 mL于250 mL三角瓶中培养。本次试验通过优化高产胆固醇氧化酶菌株的发酵条件,使酶活达到3501 U/L,明显高于优化前的酶活量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 胆固醇的性质及作用
• 1.2 胆固醇与人体健康
• 1.3 降低胆固醇的方法
• 1.3.1 胆固醇氧化酶
• 1.3.2 胆固醇还原酶
• 1.3.3 红曲霉
• 1.3.4 乳酸菌
• 1.4 胆固醇氧化酶的研究进展
• 1.4.1 胆固醇氧化酶的分类和特点
• 1.4.2 胆固醇氧化酶的来源
• 1.4.3 胆固醇氧化酶的作用机理
• 1.4.4 胆固醇氧化酶的检测
• 1.4.5 胆固醇氧化酶的应用
• 1.5 菌种鉴定
• 1.6 发酵条件优化
• 1.7 国内外研究现状
• 1.8 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验器材
• 2.1.3 实验样品
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 其他溶液试剂的配制
• 2.1.6 测酶活试剂的配制
• 2.1.7 菌种鉴定所需试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 高产胆固醇氧化酶菌种的筛选
• 2.2.1.1 初筛
• 2.2.1.2 复筛
• 2.2.2 高产胆固醇氧化酶菌株的选择
• 2.2.3 高产胆固醇氧化酶菌株的鉴定
• 2.2.4 产酶发酵条件优化
• 第三章 实验结果
• 3.1 高产胆固醇氧化酶菌株的筛选
• 3.1.1 菌株初筛结果
• 3.1.2 菌株复筛结果
• 3.2 高产胆固醇氧化酶菌株的鉴定
• 3.2.1 菌落及细胞形态学观察
• 3.2.2 细菌菌种鉴定结果
• 3.2.3 酵母菌鉴定结果
• 3.2.4 酵母菌发酵产酶条件优化
• 第四章 结果讨论
• 参考文献
• 致谢