丙酸杆菌VB12合成及耦合发酵工艺研究

论文摘要

钴胺素是人体组织代谢过程中必需的维生素,具有广泛的生理作用。广泛应用于医药和食品行业。目前钴胺素主要由微生物发酵生产。本论文从应用角度出发,初步研究了DMB、丙酸等因素对腺苷咕啉醇酰胺（关键中间产物）、菌体生长及脱氧腺苷钴胺素（adenosylcobalamin,简称ADO）生物合成的影响,探索了解除有机酸（丙酸）抑制的发酵工艺过程,期望为钴胺素发酵生产工艺的改进提供参考借鉴。本论文主要进行了以下两方面的研究。1.丙酸杆菌厌氧合成维生素B12研究在费氏丙酸杆菌（propionibacterium freudenreichii）发酵生产维生素B12的研究中,分离到脱氧腺苷钴胺素生物合成途径中一种关键而稳定的中间产物。该物质在维生素B12发酵过程中大量积累,在研究中发现该中间产物腺苷钴啉醇酰胺（CBI）与5,6-二甲基苯并咪唑（DMB）来源的前体α-吡咯核糖（α-ribozale）结合后可转化为脱氧腺苷钴胺素（ADO）。光谱和质谱分析该物质应是脱氧腺苷钻胺素生物合成途径中的一种重要中间产物—腺苷钴啉醇酰胺（adenosylcobinamide,简称CBI）。对此中间产物的分析可深入了解厌氧合成脱氧腺苷钴胺素的代谢途径。进一步以CBI为核心,考察不同时间添加DMB对菌体生长及ADO合成的影响,从而运用代谢调控手段优化DMB的添加时间。从而优化发酵工艺,指导发酵生产维生素B12的生产实践。批次发酵条件下,考察了菌体的CBI合成量,ADO产量和菌体的生长曲线,可确定DMB对菌体生长的抑制作用并不明显,但可抑制CBI在细胞内的生物合成,因此可影响单位菌体产量。2.反应与分离耦合的发酵工艺研究初步探索了用离子交换树脂吸附和更换新鲜培养基两种方法解除有机酸抑制对费氏丙酸杆菌发酵生产VB12的影响。初步探索了发酵过程中定时对丙酸进行分离的发酵工艺,可有效解除有机酸对细胞生长的抑制,实现了细胞的连续生长,为连续发酵的生产工艺提供了借鉴。进一步考查了弱碱性阴离子交换树脂ZGA330对费氏丙酸杆菌发酵液中丙酸的静态和动态吸附性能。树脂ZGA330对含有12.6g/L丙酸的发酵液中丙酸的静态吸附量最大,吸附量为44.9g/L；动态吸附过程中对发酵液中主要营养成分糖、氨基酸吸附很少,而对丙酸吸附量高达205.5g/L。成功地通过树脂吸附将发酵系统中的丙酸分离出去,实现了维生素B12的高密度发酵。研究结果为丙酸的发酵与吸附分离耦合过程研究提供了基础,丙酸吸附分离后的发酵液继续进行维生素B12发酵生产可以解除丙酸的抑制作用,提高了维生素B12的产量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 钴胺素简介
• 1.2 钴胺素的分子结构与理化性质
• 1.2.1 钴胺素的分子结构
• 1.2.2 钴胺素的物理与化学性质
• 1.2.3 钴胺素的检测方法
• 1.3 钴胺素的生物合成研究
• 1.3.1 钴胺素的生物合成途径
• 1.3.2 钴胺素合成相关基因的研究
• 1.4 钴胺素的生产
• 1.4.1 工业废液中提取钴胺素
• 1.4.2 污泥中提取钴胺素
• 1.4.3 微生物纯种发酵
• 1.4.4 混合培养发酵生产
• 1.4.5 转基因的E.Coli.发酵生产
• 1.5 费氏丙酸杆菌发酵生产钴胺素
• 1.5.1 概述
• 1.5.2 发酵工艺研究
• 1.5.4 钴胺素的提取工艺
• 1.6 丙酸简介
• 1.6.1 菌种的选育
• 1.6.2 发酵机理和培养条件的研究进展
• 1.6.3 消除反馈抑制的研究
• 1.6.4 耦合发酵的研究进展
• 1.7 本论文研究目的及意义
• 12合成研究'>第2章 丙酸杆菌维生素B₁₂合成研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种及培养基
• 2.2.2 主要仪器与试剂
• 2.2.3 费氏丙酸杆菌的发酵
• 2.2.4 分析方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 腺苷钴啉醇酰胺与脱氧腺苷钴胺素的关系
• 2.3.2 腺苷钴啉醇酰胺的光谱分析
• 2.3.3 腺苷钻啉醇酰胺的液-质联用分析
• 2.4 小结
• 12的影响'>第3章 DMB对费氏丙酸杆菌生长及合成VB₁₂的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种及培养基
• 3.2.2 主要仪器与试剂
• 3.2.3 菌体的发酵
• 3.2.4 菌体的收集与处理
• 3.2.5 分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 DMB添加时间对ADO合成的影响
• 3.3.2 DMB对CBI合成的影响
• 3.3.3 DMB对菌体生长的影响
• 3.4 小结
• 第4章 丙酸杆菌耦合发酵工艺研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种及培养基
• 4.2.2 主要仪器与试剂
• 4.2.3 菌种的发酵
• 4.2.4 菌体的收集与处理
• 4.2.5 分析方法
• 4.2.6 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 离心换料解除有机酸抑制对生物量及钴胺素合成的影响
• 4.3.2 固定床定时吸附丙酸对菌体生长和脱氧腺苷钴胺素合成的影响
• 4.4 小结
• 第5章 离子交换法吸附分离发酵液中的丙酸研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 树脂
• 5.2.3 试剂
• 5.2.4 实验仪器
• 5.2.5 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 各因素对树脂的静态吸附-解吸附的影响
• 5.3.2 各因素对动态吸附-解吸附的影响
• 5.3.3 发酵液中部分去除丙酸对发酵的影响
• 5.4 结论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 发表论文情况
• 致谢