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生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件研究

2020-12-10阅读(326)

生物柴油基因工程菌的构建及酿酒酵母产油脂条件研究

论文摘要

生物柴油是目前研究的热点,其生产方法是将原料脂肪和甲醇或乙醇在化学催化剂或生物催化剂的催化下,转化合成生物柴油。目前生物柴油的生产最少需要两步：油脂的获得和将油脂转化为生物柴油。如果能将这两步集成在同一个生物体系中,将会大大缩短步骤,提高生物柴油的转化效率。通过构建生物柴油基因工程菌,将生物柴油专用脂肪酶的基因在酵母中表达,有可能直接把酵母合成的油脂和乙醇在重组体系产生的脂肪酶催化下合成脂肪酸乙酯,从而获得一种高效的生物柴油生产新技术。本文克隆了假丝酵母脂肪酶的成熟肽基因Lip2,同时克隆了酿酒酵母的强启动子PGK1和终止子CYC1,构建了两个重组表达载体pYES2-Lip2和YEp352-PLC,使得脂肪酶基因在酿酒酵母（Saccharomycescerevsiae）中进行胞内表达；同时,本文利用响应面法对酿酒酵母产油脂条件进行了优化。本文对此设想进行了如下主要工作：1、以假丝酵母（Candida sp.99-125）基因组为模板PCR扩增得到大小为903bp的目的基因片段Lip2,经A-T克隆转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子进行验证及序列测定,测定结果与报道完全一致；Lip2基因片段经过双酶切处理后插入到pYES2质粒中,成功构建了重组表达载体pYES2-Lip2,经过半乳糖诱导表达后,由SDS-PAGE鉴定表明,目的蛋白在胞内有表达,而在胞外基本没有表达。但是酶活检测结果表明,胞内目的蛋白基本上没有活性。2、以酿酒酵母（Saccharomyces cerevsiae）基因组为模板PCR扩增得到大小为781bp的启动子基因片段PGK1,以质粒pYES2为模板PCR扩增得到大小为260bp的终止子基因片段CYC1,经A-T克隆转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子进行验证及序列测定,测定结果与报道完全一致；通过重叠PCR法把Lip2基因与CYC1基因融合后,然后把经过酶切处理后的PGK1基因和融合基因插入到YEp352质粒中,成功构建了重组表达载体YEp352-PLC,由SDS-PAGE鉴定表明,目的蛋白在胞内有表达,而在胞外基本没有表达。酶活检测结果表明,胞内目的蛋白具有1.3U/mL左右的酶活。3、运用响应面法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）产油脂以及发酵条件优化进行了研究。首先根据单因素实验结果,利用Plackett-Burman设计对影响其产油脂相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的3个因素：柠檬酸,CaCl2和初始pH值。接着用最陡爬坡试验逼近以上3个因子的最大响应区域后,采用Box-Behnken设计以及响应面分析法,确定其优化后发酵条件为（w/v）：葡萄糖15%,蛋白胨0.2%,酵母浸粉0.4%,柠檬酸0.471%,MgSO4·7H20 0.1%,ZnS04·7H20 0.2%,CaCl20.025%,FeS04·7H200.005%,初始pH值为6.74,180 r/min,30℃培养96h。优化后的油脂产率（干重）达到14.55%,比在种子培养基中油脂产率4.76%提高了2倍左右。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 生物柴油概述
  • 1.1.1 生物柴油主要理化性质
  • 1.1.2 生物柴油主要生产方法概述
  • 1.1.3 生物柴油目前研究状况
  • 1.2 微生物油脂概述
  • 1.2.1 微生物油脂常规优化方法
  • 1.2.2 微生物油脂代谢调控机理分析
  • 1.3 脂肪酶概述
  • 1.3.1 脂肪酶的理化性质
  • 1.3.2 脂肪酶的底物特异性
  • 1.3.3 脂肪酶在真菌中表达研究
  • 1.3.4 影响微生物脂肪酶基因表达的因素
  • 1.4 酿酒酵母表达系统的研究
  • 1.4.1 酵母表达系统的特点
  • 1.4.2 酿酒酵母表达系统的特点
  • 1.5 酿酒酵母油脂的研究
  • 1.6 本课题的研究目的及思路
  • 第二章 酿酒酵母启动子基因PGK1的克隆
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌株与质粒
  • 2.2.2 实验试剂及仪器设备
  • 2.2.3 培养基
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 酿酒酵母基因组DNA的提取
  • 2.3.2 PCR扩增启动子PGK1基因
  • 2.3.3 从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段
  • 2.3.4 目的基因与T载体的连接
  • 2.3.5 重组质粒的电转化
  • 2.3.6 阳性克隆的筛选
  • 2.3.7 PCR产物的克隆和序列分析
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.5 小结
  • 第三章 假丝酵母（Candida sp.99-125）脂肪酶基因Lip2的克隆
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 菌株与质粒
  • 3.2.2 实验试剂及仪器设备
  • 3.2.3 培养基
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 假丝酵母基因组DNA的提取
  • 3.3.2 PCR扩增脂肪酶Lip2基因
  • 3.3.3 从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段
  • 3.3.4 目的基因与T载体的连接
  • 3.3.5 重组质粒的电转化
  • 3.3.6 阳性克隆的筛选
  • 3.3.7 PCR产物的克隆和序列分析
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 脂肪酶基因Lip2的PCR扩增
  • 3.4.2 重组子的鉴定
  • 3.4.3 测序结果分析
  • 3.5 小结
  • 第四章 生物柴油基因工程菌的构建及表达
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 菌株与质粒
  • 4.2.2 实验试剂及仪器设备
  • 4.2.3 培养基
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 PCR扩增终止子基因CYC1
  • 4.3.2 从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段
  • 4.3.3 目的基因与T载体的连接
  • 4.3.4 重组质粒的电转化
  • 4.3.5 阳性克隆的筛选
  • 4.3.6 PCR产物的克隆和序列分析
  • 4.3.7 重叠PCR
  • 4.3.8 YEp352-PLC重组表达质粒的构建
  • 4.3.9 pYES2-Lip2重组表达质粒的构建
  • 4.3.10 重组子的鉴定
  • 4.3.11 酿酒酵母感受态细胞的制备
  • 4.3.12 酿酒酵母的电转化
  • 4.3.13 重组酿酒酵母的筛选
  • 4.3.14 重组酵母的菌落PCR鉴定
  • 4.3.15 蛋白质浓度的测定
  • 4.3.16 重组蛋白的SDS—PAGE分析
  • 4.3.17 脂肪酶酶活测定
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 终止子基因CYC1的PCR扩增
  • 4.4.2 测序结果分析
  • 4.4.3 pYES2-Lip2重组子的鉴定
  • 4.4.4 重叠PCR结果
  • 4.4.5 YEp352-PLC重组子的鉴定
  • 4.4.6 重组酵母的筛选
  • 4.4.7 重组酵母的菌落PCR鉴定
  • 4.4.8 重组蛋白（YEp352-PLC）的SDS—PAGE分析结果
  • 4.4.9 脂肪酶酶活的测定
  • 4.5 小结
  • 第五章 响应面法优化酿酒酵母产油脂条件研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料
  • 5.2.1 菌种
  • 5.2.2 培养基及培养条件
  • 5.3 实验方法
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 Plackett-Burman设计筛选影响产油因子
  • 5.4.2 最陡爬坡实验设计及其结果
  • 5.4.3 响应面设计确定显著影响因子的最佳值
  • 5.5 小结
  • 第六章 结论
  • 第七章 问题与建议
  • 参考文献
  • 附录一 试剂
  • 附录二 仪器设备
  • 致谢
  • 研究成果及发表的学术论文
  • 作者和导师简介
  • 北京化工大学 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书

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