人乳头瘤病毒16型E2蛋白对巨噬细胞分泌活性及凋亡的影响

论文摘要

目的：构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白及其N端结构域（TAD）和C端结构域（DBD）与绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白真核表达载体，观察融合蛋白在Hela细胞或巨噬细胞（MΦ）中的定位。研究HPV16E2蛋白及其TAD、DBD对MΦ分泌TNF-α和IL-1β及细胞凋亡率的影响。方法：（1）用Primer5.0引物设计软件设计引物，聚合酶链反应（PCR）扩增HPV16E2及其TAD、DBD基因。PCR产物经双酶切后与pEGFP-C1载体相应酶切位点连接，转化E.coli JM109，经酶切和测序鉴定，筛选阳性克隆，构建真核表达载体pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。（2）将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD各0.5μg分别转染Hela细胞或MΦ。36h后，倒置荧光显微镜下观察GFP-HPV16E2、GFP-HPV16E2TAD、GFP-HPV16E2DBD在Hela细胞或MΦ中的分布及定位。（3）用佛波酯（PMA）诱导THP-1为MΦ；将MΦ分为空白组、GFP组、GFP-E2组、GFP-E2TAD组及GFP-E2DBD组。除空白组外，每组分别转染0.5μgpEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD。转染48h后，取细胞培养上清液, ELISA测定TNF-α和IL-1β的含量；收集细胞，流式细胞术（FCM）检测MΦ凋亡。结果：（1） PCR产物分别连接至pEGFP-C1载体上后，双酶切及测序结果表明目的片段与HPV16E2、TAD、DBD基因正确连接入pEGFP-C1。真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD分别转染Hela细胞或MΦ后，GFP-DBD融合蛋白定位于细胞核内，GFP-TAD定位于细胞浆，GFP-E2、GFP在细胞核、浆内均有表达，但GFP-E2表达组细胞核荧光亮度强于细胞浆。（2）质粒转染MΦ48h后，细胞培养上清中TNF-α、IL-1β的含量GFP-E2组（321.83±22.00，214.35±22.79）、GFP-TAD组（371.79±22.73，233.52±17.75）明显高于GFP组（265.74±28.74,167.60±18.68）和空白组（234.76±31.94,155.13±20.54）（P<0.05），且GFP-TAD组与GFP-E2组TNF-α浓度差异有统计学意义（P<0.05）；GFP-TAD组IL-1β含量略高于GFP-E2组，但差异无统计学意义（P>0.05）；GFP-DBD（265.74±28.74，167.60±18.68）与GFP组或空白组TNF-α及IL-1β含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（3）在MΦ凋亡率检测中，GFP-E2组（11.53±0.54）、GFP-TAD组（14.57±0.59）明显高于GFP组（4.53±0.37）或空白组（5.20±0.65）（P<0.05），且GFP-TAD组MΦ凋亡率高于GFP-E2组（P<0.05）；但GFP-DBD组（4.92±0.49）与GFP组或空白组比较，MΦ凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：（1）构建的真核表达载体pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD均能在Hela细胞或MΦ中表达，GFP-DBD定位于细胞核，GFP-TAD定位细胞浆。（2） HPV16E2及其TAD即时高表达上调MΦ分泌TNF-α和IL-1β。（3） HPV16E2及其TAD即时高表达可诱导MΦ凋亡。

论文目录

• 主要英文缩略语索引
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢