论文摘要
研究背景及目的:卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,及早发现可以有效提高病人生存率,但由于发病隐匿,无明显症状,往往病情会被忽视,因此,卵巢癌又称为“沉默杀手”。据统计,在100 000个妇女中,就有3.8位死于此病。虽然近20年来在卵巢癌治疗方面取得了长足进展,但均未能显著改善患者的长期生存率。因此,针对能有效抑制肿瘤细胞生长的新抗癌药的不断开发应用,是十分迫切的任务。目前抑制肿瘤细胞的生长主要通过两个方面:一方面可以通过改变细胞的周期,使其不能进行正常的有丝分裂,另外一方面可以通过促进细胞凋亡,通过改变凋亡相关蛋白表达水平来增加了肿瘤细胞凋亡率,抑制肿瘤细胞的增殖和集落形成能力,提高肿瘤细胞化疗药物和放疗的敏感性。弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,其寄生于宿主细胞过程中,虫体与细胞的生物学特性均会发生改变:研究二者间的联系,一直是国内外关注的焦点。业已证实的是弓形虫在寄生过程中可以抑制宿主细胞增值,引起细胞周期改变,并且诱导宿主细胞凋亡。本文利用液氮保种小鼠传代及CF-11纤维素纯化的方法提取制作弓形虫培养上清液,将其视为一种生物制剂在体外条件下人卵巢癌细胞SKOV-S细胞共培养,来观察弓形虫培养上清液对SKOV-S细胞生物学行为影响。方法:1.采用四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的吸光度（A490值）并按公式计算卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖抑制率。2. PI染色后,上流式细胞仪技术检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞周期。3. Annexin-v-FITC/PI染色后,上流式细胞仪技术检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞凋亡率。4.荧光显微镜观察空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞在不同时项形态改变情况。5.采用琼脂糖凝胶电泳观察培养上清处理组的凋亡DNA条带。6.采用western blot,对培养上清处理前后,卵巢癌细胞SKOV-3细胞周期蛋白cyclinB1、cdc2及凋亡蛋白bcl-2及bax表达量进行检测。结果:1. MTT法检测结果显示卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖抑制率随着刚地弓形虫速殖子培养上清浓度和作用时间增加均明显增大,弓形虫速殖子培养试验组抑制率与对照组之间比较差异均有统计学意义（p﹤0.05）。2.培养上清作用于卵巢癌细胞SKOV-3细胞48h后,对照组与3×107、6×107、12×107 / mL数量的弓形虫速殖子培养上清组的卵巢癌细胞SKOV-3细胞G2/M期细胞比例分别为（22.43±3.78）%、（35.56±5.22）%、（38.76±3.19）%、（44.95±4.74）%,以12×107 / mL数量组增加最为明显,差异具有显著性意义（n=5, p<0.05）,提示培养上清具有诱导卵巢癌细胞SKOV-3细胞G2/M期停滞的作用,且有一定剂量依赖性。3.以浓度为12×107 / mL弓形虫速殖子培养上清作用后24、36、48、72h后的卵巢癌细胞SKOV-3细胞用Annexin-v-FITC与PI双染后,FCM分析细胞凋亡,结果表明其凋亡率分别为15.23℅、16.12℅、18.23℅、17.64℅,与空白对照组0.64℅、0.83℅、1.56℅、2.67℅比较有显著差异（p﹤0.05）。4.选择与数量为12×107 / ml弓形虫速殖子培养上清作用不同时间段的细胞置荧光显微镜下观察,可见2种细胞形态:早期凋亡细胞,细胞膜着绿色,核拒染;凋亡中晚期细胞与坏死细胞,核着红色,细胞膜着绿色,空白对照组的正常细胞不着色。5.以浓度为12×107/ml弓形虫速殖子培养上清作用细胞不同时间后的琼脂糖凝胶电泳均出现了相差约180-200bp的典型的细胞凋亡的DNA梯形条带。6.弓形虫速殖子培养上清作用前卵巢癌细胞SKOV-3细胞可见周期蛋白cyclinB1、cdc2与凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达的表达。上清作用48h后,与对照组相比,不同处理组的cyclinB1表达量（表达积分光密度值,下同）为0.86+0.04、0.73+0.06、0.60+0.05 ;cdc2蛋白表达量为0.98+0.02, 0.84+0.05、0.65+0.06;cyclinB1蛋白表达量为0.97+0.05, 0.81+0.02和0.78+0.05;cdc2蛋白表达量为1.23+0.03, 1.54+0.04、1.75+0.02,与对照组相比均有显著性差异（p<0.05）,以12×107 / mL数量的弓形虫速殖子组最为明显（p﹤0.05）。结论:弓形虫速殖子培养上清对体外培养卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖有明显的抑制作用,其途径可能与调节周期蛋白cyclinB1、cdc2等蛋白表达或活性改变引起细胞株G2/M期阻滞有关;同时,弓形虫速殖子培养上清还可通过上调凋亡相关蛋白Bax表达和下调Bcl-2表达来促使卵巢癌细胞SKOV-3细胞凋亡。