CD25结合位点修饰性hIL-2在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

论文摘要

白细胞介素2（IL-2）是一种15kDa大小的单体球状糖蛋白，其分子空间结构具有4个α螺旋并进一步折叠成典型的Ⅰ型细胞因子结构。IL-2在体内主要由活化的T细胞分泌，能够促进T细胞、B细胞及NK等细胞大量增殖，促进B细胞分化和分泌抗体。hIL-2是一种天然的免疫增强剂，具有很强的抗感染、抗肿瘤等多种作用。IL-2在体外能够诱导淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）增殖，据此，人们将IL-2和LAK细胞联合应用治疗晚期肿瘤病人，并取得了一定疗效。然而，IL-2治疗肿瘤的效果被严重的毒副作用限制着。近年来大量的研究结果揭示，IL-2在体内的主要作用为维持调节性T细胞（Treg）的生存和增殖，由此进一步发挥免疫抑制作用。多年以来，科学家致力于研究新型修饰性hIL-2，期望提升其抗肿瘤活性的同时降低其毒副作用。本试验根据人白细胞介素2（hIL-2）的氨基酸序列和三维结构，在不改变其空间构象的基础上修饰其基因序列，使修饰后的hIL-2（mhIL-2）蛋白失去了与CD25亚基结合的能力。采用人工合成的方法合成了目的基因片段并将其插入真核表达载体pPIC9K中，构建了mhIL-2的表达载体pPIC9k-mhIL-2，利用毕赤酵母对mhIL-2进行了表达。MhIL-2经诱导表达后，对表达上清液进行了SDS-PAGE、Western blot检测。测定结果显示我们高效表达出了mhIL-2，相对分子量为15kDa。分别利用脱盐层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对mhIL-2进行纯化，纯化后的mhIL-2经SDS-PAGE鉴定为一单一条带，说明mhIL-2被成功纯化出来，纯品mhIL-2浓度为0.45g/L。在mhIL-2活性实验中，mhIL-2能够很好的刺激IL-2依赖性CTLL-2细胞增殖。体内活性实验中发现mhIL-2可以高效的增强小鼠机体的免疫能力。本实验为进一步研究高效的，低副作用的hIL-2产品奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 白细胞介素 2
• 1.1.1 IL-2 基因结构及蛋白特征
• 1.1.2 IL-2 的生物活性
• 1.2 IL-2 受体（IL-2R）
• 1.2.1 IL-2R 的分子特征
• 1.2.2 IL-2R 信号转导及体外 IL-2R 的表达
• 1.3 体内 IL-2 和 IL-2R 的表达
• 1.4 IL-2 分泌的调节
• 1.5 IL-2 对免疫系统的影响
• 1.5.1 IL-2 与 T 细胞凋亡
• 1.5.2 IL-2 对 Treg 细胞的作用
• 1.5.3 IL-2 与自身免疫疾病的联系
• 1.6 IL-2/IL-2R 功能紊乱—起因及影响
• 1.7 IL-2 在免疫治疗中的应用
• 1.8 本试验研究目的与意义
• 第二章 PPIC9K-MHIL-2 表达载体的构建及转化毕赤酵母 GS115
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 主要仪器和试剂
• 2.1.2 溶液的配制及培养基
• 2.1.3 感受态细胞的制备
• 2.1.4 pPIC9K-mhIL-2 重组表达载体的构建
• 2.1.5 重组表达载体 pPIC9K-mhIL-2 转化毕赤酵母 GS115
• 2.1.6 阳性转化子的筛选
• 2.2 结果
• 2.2.1 pPIC9K-mhIL-2 重组表达载体的构建
• 2.2.2 重组表达载体 pPIC9K-mhIL-2 转化毕赤酵母 GS115
• 2.3 讨论
• 第三章 MHIL-2 的诱导表达与纯化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器和试剂
• 3.1.2 溶液的配置及培养基
• 3.1.3 MhIL-2 的诱导表达及 SDS-PAGE、Western blot 鉴定
• 3.1.4 MhIL-2 的纯化
• 3.1.5 MhIL-2 浓度测定
• 3.2 结果
• 3.2.1 表达产物的 SDS-PAGE 及 Western Blot 检测
• 3.2.2 MhIL-2 的纯化
• 3.2.3 mhIL-2 浓度测定
• 3.3 讨论
• 第四章 MHIL-2 活性测定
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 主要仪器和试剂
• 3H-TdR 法测定 mhIL-2 活性'>4.1.2³H-TdR 法测定 mhIL-2 活性
• 4.1.3 MhIL-2 体内活性的测定
• 4.2 结果
• 3H-TdR 法测定 mhIL-2 活性'>4.2.1³H-TdR 法测定 mhIL-2 活性
• 4.2.2 MhIL-2 体内活性实验
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历