来源于宏基因组的糖苷酶的筛选、性质表征及应用

论文摘要

环境微生物是自然界中分布最广、种类最多、数量最大的生物类群,是蛋白和活性小分子资源的宝库。但传统微生物培养方法对于这些微生物资源的开发利用是有其局限性的,因为绝大部分环境微生物目前在实验室还是无法获得培养的,这在很大程度上限制了人们对微生物资源的开发和利用。上个世纪90年代出现了宏基因组技术,使得开发不可培养微生物资源成为了现实,人们采用宏基因组技术,获得了大量新的蛋白和生物活性小分子。为了进一步探索糖苷酶的生物学意义,使其在工业生产领域发挥重要作用。本研究利用选择性培养基从构建深海淤泥的宏基因组文库中,活性筛选到一株糖苷酶的克隆（GluD142）基因,克隆到的DNA序列全长1395bp,编码465氨基酸,分子量约为52.0kD。将其目的基因亚克隆到原核表达载体pET-32a（+）载体上转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主中,用IPTG诱导表达,目的蛋白表达量可以达到总蛋白量的72.7%,并且目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。对糖苷酶GluD142酶学性质表征的结果表明,该酶的最适反应温度为37℃和pH值为7.5。该糖苷酶（GluD142）具有较好的热稳定性,在40℃的条件下可以较长时间的保持活性,在45℃下保温2h后仍能保持约50%的剩余相对活力。不同pH值条件下保温16h后结果表明,该酶在pH值6.0—7.5条件下,仍能够保持大于80%的剩余相对活力,在pH值5.5和pH值8.0时可以保持约50%的剩余相对活力,而在低于或高于此范围时,GluD142的相对活力迅速下降。Cu2+、Mn2+和Ni2+对该糖苷酶的水解活性有明显的促进作用,Mg2+和Zn2+对于该糖苷酶的水解活性影响不大,而K+、Na+、Co2+以及Ca2+对于该糖苷酶的水解活性有很大的抑制作用。此酶在10%的甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及正己烷中,其水解活性有120%—150%不等的提高。甚至在40%的正己烷中,GluD142的相对水解活性还可以保持近乎100%,DMSO有机溶剂对其水解活性有很明显的抑制作用。用MCFs载体固定此糖苷酶,催化合成烷基糖苷和白藜芦醇,并对固定化条件进行选择,以及固定化糖苷酶对合成其产物反应的条件进行初步研究。实验结果显示,在生成烷基糖苷的体系中,当醇糖摩尔比为4：1,水相达到30%,在42℃,pH值6.5的条件下,反应48h即可得到烷基糖苷初产品。通过对虎杖苷发酵工艺的研究,可以得到优化的反应体系,即当酶液、虎杖苷溶液和缓冲液摩尔量在1：5：5的基础上,37℃pH值6.5的条件下,反应16h,即可得到白藜芦醇初产物。总体说来,我们通过宏基因组新酶技术筛选得到了一种新的未见报道的糖苷酶,通过对其酶学性质表征,揭示此酶可以在大肠杆菌中实现高效表达,该酶对有机溶剂具有较好的耐受能力以及具有较宽泛的底物选择性,对其应用的研究初步表明此酶对转糖基反应具有较高催化效率,证明糖苷酶GluD142是具有潜在应用价值的一种新糖苷酶分子。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 ：绪论
• 1.1 宏基因组学的概述
• 1.1.1 宏基因组学研究策略
• 1.1.2 宏基因组技术的应用
• 1.2 糖苷水解酶家族概述
• 1.2.1 糖苷酶的分类
• 1.2.2 糖苷酶的作用机理
• 1.2.3 糖苷酶在工业生产中的应用及意义
• 1.3 固定化酶催化合成烷基糖苷
• 1.3.1 酶催化合成烷基糖苷的作用机理
• 1.3.2 烷基糖苷的研究现状
• 1.4 白藜芦醇的研究概述
• 1.4.1 白藜芦醇的性质及特点
• 1.4.2 白藜芦醇的研究现状及趋势
• 1.5 本课题研究的背景及意义
• 第二章 ：宏基因组文库的构建
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 第三节 结果与分析
• 2.3.1 宏基因组总DNA提取结果
• 2.3.2 宏基因组文库的质量鉴定
• 第四节 小结与讨论
• 第三章 ：糖苷酶基因的筛选以及表达载体的构建
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 第三节 结果与分析
• 3.3.1 糖苷酶活性筛选
• 3.3.2 表达载体的构建
• 3.3.3 序列分析与测定
• 3.3.4 糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达
• 第四节 小结与讨论
• 第四章 ：糖苷酶GluD142活性表征
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 第三节 结果与分析
• 4.3.1 糖苷酶GluD142蛋白的表达以及纯化
• 4.3.2 糖苷酶GluD142酶学特性分析
• 第四节 小结与讨论
• 第五章 ：糖苷酶催化合成烷基糖苷以及白藜芦醇
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 第三节 结果与分析
• 5.3.1 糖苷酶GluD142固定化分析
• 5.3.2 烷基糖苷反应体系以及检测分析
• 5.3.3 白藜芦醇产物的检测分析
• 第四节 小结与讨论
• 第六章 ：课题总结与展望
• 6.1 课题总结
• 6.1.1 宏基因组文库的成功构建
• 6.1.2 功能筛选到糖苷酶的性能分析
• 6.1.3 糖苷酶固定化的研究
• 6.1.4 糖苷酶转糖基反应以及产物检测
• 6.2 课题的创新及意义
• 6.3 展望
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所发表论文