论文摘要
目的：本研究所已从一株Armillariella tabescens E-20菌株分离得到一种能够去除黄曲霉毒素的蛋白酶，命名为黄曲霉毒素解毒酶（Aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ），该基因全长cDNA已被克隆，并已实现其在毕赤酵母表达系统中的分泌表达。研究已经表明：黄曲霉毒素解毒酶（ADTZ），是一种具有氧化还原作用的新加氧酶，但是对黄曲霉毒素解毒酶的结构和功能的了解甚少，虽然在ADTZ结构与功能的生物学预测方面可获取一些信息，但是却难以解释其实际的功能。无论是X-ray，NMR方法测定蛋白质结构，速度缓慢，实验造价高，所以有必要借助理论预测的方法来加速蛋白质结构的测定。基于GFP对相关蛋白的结构生物学分析，及蛋白质相互作用的探索，此方向一直是国外此领域研究的热门，虽然只有短短十几年，但成果显著。探索一个新颖的方式——结构生物学和生物信息学去研究蛋白的结构。这正是当今生物学的一个热门领域。因此，本文通过建立蛋白质折叠报告系统——proGFP，高通量鉴定ADTZ的可溶性区段，结合生物信息学分析工具对ADTZ全序列和可溶区段序列进行分析，以获得指导进一步研究ADTZ结构与功能的实验结果。方法：（1）改造ADTZ去除HindⅢ位点：通过重叠延伸PCR的定点突变法，引入突变位点，对ADTZ进行改造，在氨基酸水平上不发生突变的情况下，达到去除HindⅢ位点的目的，使其符合实验操作要求。（2）截短型ADTZ片段制备：选用T-PCR法（标记随机引物PCR），获得目标序列中的随机小片段，并人为的设计酶切位点，用于进一步筛选实验。（3）ADTZ可溶性区段筛选：利用绿色荧光蛋白（GFP）报告体系，上游蛋白的快速折叠直接影响下游GFP的有效折叠，从而影响生色团的形成的原理。通过该体系所放出与正确折叠蛋白成正比的报告信号（绿色荧光），筛选可溶性片段。（4）ADTZ结构与功能生物学分析：使用结构生物学与功能生物学预测工具对于ADTZ结构与功能信息进行综合分析。（5）比较分析ADTZ序列可溶性区段序列的生物学信息。结果：（1）成功应用重叠引物PCR法有效的去除了ADTZ上的HindⅢ位点，为了进一步的筛选实验获得可操作的ADTZ突变模板。（2）使用T-PCR技术扩增ADTZ截短型标记HindⅢ位点的随机片段。（3）成功利用T-PCR技术和proGFP筛选可溶性片段联用高通量筛选技术，鉴定出了黄曲霉毒素解毒酶（ADTZ）中的可溶性截短型片段：ADTZ-sub 3（第259-394残基）和ADTZ-sub 5（第101-194残基），ADTZ-sub 6（第150-193残基）。（4）从结构信息学入手，我们将ADTZ二级结构，ADTZ疏水结构，ADTZ折叠区，非折叠区，球状区域，以及构象变化等信息，叠加在一起，进行综合分析，发现存在着三个比较可靠的折叠区域：折叠区1（1-175氨基酸残基），折叠区2（225-425氨基酸残基）和折叠区3（500-695氨基酸残基）。（5）功能生物学分析发现ADTZ含有与金属蛋白酶M49家族相同的结构域。HEXXXH结构，这个结构是一个锌依赖的酶活性位点结构，M49家族蛋白具有二肽基激酶Ⅲ（dipeptidyl peptidaseⅢ）的功能，能够催化含有四个或以上残基的二肽从N端释放，该结构与目前所发现的ADTZ的功能是否有关，需进一步证实。（6）通过筛选到的片段与结构和功能信息学比较发现，金属蛋白酶M49家族相同结构域则跨越了折叠区2和折叠区3，而将所有潜在的Domain进行综合分析，在结构层次来看，相当多的集中在折叠区1范围内，而另一部分Domain则覆盖了折叠区2和折叠区3，这将为今后的ADTZ功能与结构相关实验提供可靠的实验参考数据。结论：本实验摸索了一条研究低同源性蛋白功能结构的工作思路，是进一步研究黄曲霉毒素解毒酶的结构与功能一个重要基础工作，通过T-PCR与GFP筛选报告体系技术的联用，在无需对目的蛋白片段进行功能、结构或生物学分析的情况下，可达到筛选可溶性片段的目的，避开繁杂的纯化与结晶。本研究获得可供后续研究ADTZ底物结合中心和催化中心的可溶性截短ADTZ肽段。
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标签：黄曲霉毒素解毒酶论文; 绿色荧光蛋白论文; 可溶性区域论文; 结构信息学论文;