三七总皂苷抗缺血诱导的大鼠心肌细胞凋亡的作用及机制研究

论文摘要

目的已有研究表明三七总皂苷（panax notoginseng saponin PNS）对缺血心脏具有良好的保护作用,但是PNS保护缺血心脏的具体分子作用机制现在还不清楚。本课题拟探讨PNS对缺血诱导的心肌细胞凋亡是否有抑制作用,以及PNS抑制细胞凋亡的可能分子作用机制。方法将H9c2细胞分为正常对照组（control）,模型组（model）和PNS不同浓度（0.01g/L, 0.05g/L,0.25g/L,0.5g/L,0.75g/L,2.25g/L和3.75g/L）组。Control组细胞用含10%血清的DMEM/F12培养基于普通二氧化碳培养箱培养,model组细胞用无血清无糖培养基同时缺氧（serum, glucose and oxygen deprivation, SGOD）培养,给药组细胞造模的同时给予不同浓度的PNS溶液。Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率；JC-1染色检测线粒体膜电位；DCFH-DA染色检测胞内ROS水平。结扎SD雄性大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠心肌缺血模型,并将造模成功的大鼠分为心肌缺血组（ischemia）, PNS低剂量组（PNS-L 30mg/kg/d）和PNS高剂量组（PNS-H 60mg/kg/d）,另设假手术组（sham）, sham组大鼠开胸后只穿线不结扎左冠状动脉前降支。术后第二天给药组大鼠灌胃给予不同浓度PNS溶液,sham和ischemia组大鼠给予等容的生理盐水,连续灌胃六周。六周后超声心动图检查心功能,取心肌组织,冰冻切片后TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡情况。Western blot检测caspase-3, cleaved caspase-3, bcl-2, Akt, MIF, AMPK,磷酸化Akt （p-Akt）和磷酸化AMPK （p-AMPK）的表达水平。结果PNS能够抑制SGOD诱导的心肌细胞凋亡,且在一定范围内呈剂量依赖性。各组细胞凋亡率分别为：control 7.15%±1.56%, model 67.79%±3.74%（vs. control P=0.000）, PNS处理组细胞凋亡率分别为65.58%±1.90%,66.99%±2.86%,53.22%±3.62%（vs. modelP=0.006）,37.34%±2.16%（vs. model P=0.000）,31.34%±2.52%（vs. model P=0.000）, 24.42%±0.81%（vs. model P=0.000）,19.76%±5.21%（vs. model P=0.000）。而PI3K抑制剂LY294002, MIF拮抗剂ISO-1和AMPK抑制剂Compound C都能够逆转PNS抑制细胞凋亡的作用（P=0.000,P=0.003, P=000 vs. PNS2.25g/L）。PNS能够明显的降低cleaved caspase-3的蛋白表达水平,而LY294002则逆转了PNS对caspas-3活化的抑制作用。JC-1染色结果表明PNS具有稳定线粒体膜电位的作用,DCFH-DA染色结果显示PNS具有清除胞内ROS的作用。超声心动图结果显示PNS-H能够升高心肌缺血大鼠EF值（P=0.010 vs.ischemia）和FS值（P=0.004 vs. ischemia）,同时能够降低大鼠LVDd （P=0.001 vs. ischemia）值和LVDs（P=0.000 vs. ischemia）值。PNS-L对心功能也有一定的改善作用,但是与ischemia比较组间差异没有统计学意义。TUNEL染色结果显示PNS-L和PNS-H都能够降低大鼠缺血心肌组织细胞凋亡率。此外PNS还能够显著降低大鼠心肌组织中cleaved caspase-3蛋白的表达水平,促进抗凋亡蛋白bcl-2的表达。western blot结果也表明,model组p-Akt蛋白表达水平显著降低（P=0.000 vs. control）, PNS则能够显著升高p-Akt蛋白的表达水平（P=0.004 vs. model）,而PI3K特异性抑制剂LY294002有逆转PNS促进p-Akt蛋白表达的作用（P=0.002 vs. PNS 2.25g/L）;与control组比较model组MIF和p-AMPK蛋白表达水平升高具有统计学意义（P=0.047, P=0.006 vs. control）, PNS则能够进一步到升高MIF和p-AMPK蛋白的表达水平（P=0.043, P=0.003 vs. model）。心肌组织蛋白western blot结果也显示PNS-L和PNS-H都能够升高p-Akt, MIF和p-AMPK蛋白表达水平,与ischemia比较PNS-H组p-Akt, MIF和p-AMPK蛋白表达水平升高具有显著的统计学意义（P=0.000, P=0.020,P=0.010 vs. ischemia）。结论PNS能够抗线粒体途径介导的心肌细胞凋亡,其抗凋亡的机制与激活PI3K/Akt信号通路和促进MIF和p-AMPK蛋白表达有关。本研究将为进一步探讨PNS保护心脏的分子机制及将PNS更好地应用于临床治疗提供有意义的实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 目录
• 第一章 前言
• 1. 研究意义
• 2. 国内外研究现状
• 2.1 三七总皂苷药理研究进展
• 2.2 心肌缺血与细胞凋亡
• 2.3 PI3K/Akt信号通路
• 2.4 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）
• 3. 主要研究目的与内容
• 3.1 研究目的
• 3.2 研究内容
• 第二章 三七总皂苷对缺血诱导的H9C2细胞凋亡的抑制作用及其机制研究
• 1. 试剂和药品
• 2. 主要仪器
• 3. 药物及相关溶液的配制
• 4. 实验方法
• 4.1 H9c2细胞的培养
• 4.2 细胞分组及体外心肌缺血模型的制备
• 4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率
• 4.4 线粒体膜电位的检测
• 4.5 胞内ROS的检测
• 4.6 细胞蛋白的提取
• 4.7 Bradford法测定蛋白浓度
• 4.8 Western blot检测相关的蛋白
• 5. 统计学处理
• 6. 实验结果
• 6.1 PNS对H9c2细胞凋亡的影响
• 6.2 PNS对PI3K/Akt信号通路的影响
• 6.3 PNS抗H9c2细胞凋亡作用与MIF的关系
• 6.4 PNS抗H9c2细胞凋亡作用与AMPK信号通路的关系
• 7. 讨论
• 7.1 PNS对SGOD诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用
• 7.2 PNS对PI3K/Akt信号通路的影响
• 7.3 PNS对MIF和p-AMPK蛋白表达水平的影响
• 8. 小结
• 第三章 三七总皂苷对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用及机制研究
• 1. 试剂和药品
• 2. 主要仪器
• 3. 药物及相关溶液的配制
• 4. 实验方法
• 4.1 动物
• 4.2 心肌缺血模型的建立
• 4.3 动物分组及给药
• 4.4 超声心动图检查
• 4.5 标本的收集
• 4.6 冰冻切片
• 4.7 TUNEL染色
• 4.8 心肌组织蛋白的提取
• 4.9 Bradford法测定蛋白浓度
• 4.10 Western blot检测相关蛋白（同第二章4.8）
• 5. 统计学处理
• 6. 实验结果
• 6.1 PNS对大鼠心功能的影响
• 6.2 PNS对大鼠心脏体重比值（IHW）的影响
• 6.3 PNS对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响
• 6.4 PNS对p-Akt蛋白表达水平的影响
• 6.5 PNS对MIF蛋白表达水平的影响
• 6.6 PNS对p-AMPK蛋白表达水平的影响
• 7. 讨论
• 8. 小结
• 第四章 总结与展望
• 1. 总结
• 2. 创新性
• 3. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况
• 研究生毕业论文统计学审稿证明