论文摘要
目的:探讨低剂量亚硝酸钠（NaNO2）预处理对过氧化损伤鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的保护作用;同时观察其诱导PC12细胞分化的作用。方法:分别以系列浓度的NaNO2作用PC12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测NaNO2对PC12细胞活力的影响,研究剂量-效应和时间-效应关系,寻找最低促增殖效应剂量和最佳促增殖效应时间。过氧化损伤PC12细胞模型制作采用400 mmol·L-1乙醇、45 mmol·L-1NaNO2、1.1 mmol·L-1过氧化氢（H2O2）处理2 h。细胞增殖指标采用MTT、活细胞计数法、Hoechst33258荧光单染计数有丝分裂指数;细胞凋亡检测采用Hoechst33258染色计数细胞凋亡率、流式细胞术（FITC-annexinⅤ/ PI）双染法和Hoechst 33258/PI活细胞染色法;比色法测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）含量。Western-blotting检测相关蛋白表达。瑞氏染色观察PC12细胞分化状态。结果:MTT结果显示,低剂量NaNO2促进细胞增殖,高剂量抑制其增殖,剂量-效应关系呈典型的倒U型曲线。NaNO2最低促增殖剂量为（促增殖效应高于对照组的15%）0.14 mmol·L-1,最佳促增殖效应时间点出现在第24 h;400 mmol·L-1乙醇、45 mmol·L-1的NaNO2、1.1 mmol·L-1H2O2作用PC12细胞2 h,流式细胞术结果显示,细胞凋亡率分别为（50.63±2.14）%、（52.06±8.32）%、（53.6±8.51）%,用0.14 mmol·L-1NaNO2预处理细胞24 h,再分别用上述氧化剂作用2 h,细胞凋亡率分别下降为（19.71±3.19）%、（19.65±2.17）%、（18.23±4.19）%差异具有显著性（P﹤0.05）;用0.14 mmol·L-1NaNO2和一氧化氮清除剂（c-PTIO）预处理细胞24 h,再用上述氧化剂作用2 h,细胞凋亡率则分别为（32.28±7.31）%、（38.63±5.08）%、（30.75±3.81）%。Hoechst 33258染色、Hoechst 33258/PI活细胞染色计数细胞死亡率结果与其相似。用400 mmol·L-1乙醇作用PC12细胞2 h,SOD、CAT酶活性,GSH-Px、MDA含量分别为（20.95±1.68） U/mg. Prot、（11.45±0.93） U/mg. Prot、（41.17±2.72）μmol/mg. Prot、（98.38±11.5）μmol/mg .Prot,用NaNO2预处理细胞再用乙醇作用,SOD、CAT酶活性和GSH-Px、MDA含量分别为（62.38±2.98）U/mg. Prot、（19.29±0.27） U/mg. Prot、（62.59±1.41）μmol/mg.Prot、（49.38±2.93）μmol/mg.Prot;用NaNO2+c-PTIO预处理细胞24 h,再用乙醇作用2 h,SOD、CAT酶活性和GSH-Px、MDA含量分别为（40.23±1.57）U/mg.Prot、（15.98±1.9） U/mg.Prot、（51.21±1.52）μmol/mg.Prot、（73.58±14.7）μmol/mg.Prot。用NaNO2预处理再用乙醇作用组,与单纯乙醇组相比,Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量降低,Bcl-2和HIF-1α蛋白表达量升高（P﹤0.05）;c-PTIO可以部分逆转这种现象。45 mmol·L-1NaNO2和1.1 mmol·L-1H2O2处理细胞,上述各指标变化情况与乙醇组一致。瑞氏染色结果显示,0.14 mmol·L-1NaNO2作用PC12细胞48 h,明显促进PC12细胞突起生长,缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子（VEGF）表达量增加,作用效果类似神经生长因子（NGF）。c-PTIO可以部分抑制这种现象。结论:1.低剂量NaNO2促进PC12细胞增殖,高剂量抑制其增殖,剂量-效应关系呈典型的倒U型曲线。2.低剂量NaNO2预处理能够使PC12细胞抗氧化酶活性增强、脂质过氧化水平降低、HIF-1α的表达增加,对过氧化损伤的细胞有保护作用。3.低剂量NaNO2可以促进PC12细胞分化。