HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的实验研究

论文摘要

研究背景我国是乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染的高流行区,一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen,HBsAg）阳性率为9.09%,随着HBV疫苗纳入计划免疫,一些大城市HBV感染率已有所降低,但HBV感染仍然是影响人类健康的重大公共问题之一。HBV感染与肝细胞凋亡关系密切,Canbay A等认为在慢性HBV感染中,病毒为保持持续感染,宿主则为清除病毒而进行双方的较量,就病毒而言,在其增殖阶段,抑制肝细胞凋亡,可使其在细胞内持续感染,大量繁殖;就宿主而言,细胞凋亡是限制病毒复制的自然细胞反应。凋亡细胞迅速被吞噬而无毒性物质漏出时,不会发生炎症反应。但在病理条件下凋亡细胞数过多,超过吞噬细胞吞噬能力,凋亡细胞自发性裂解而内容物释放,将会导致炎症反应及组织损伤。在实际研究中,HBV感染与肝细胞凋亡之间的关系相当复杂,多种因素参与了肝细胞凋亡的调节,其中包括HBV病毒蛋白,目前研究较多的是HBx蛋白,对前C/C蛋白与肝细胞凋亡的关系研究较少。HBV全基因组前C/C区开放读框编码多种病毒蛋白,主要包括HBcAg（P21）、HBeAg（P17）、25kD（P25）蛋白、22kD（P22）蛋白等,其中HBV/P22蛋白是由P25蛋白在内质网上切割信号肽后生成,HBV/P22蛋白在细胞内组织蛋白酶作用下水解C-端肽段,形成17 kD的HBeAg（P17）分泌到细胞外,但部分HBV/P22蛋白滞留于胞浆内。长期以来,人们认为HBV前C/C区蛋白对细胞没有生物调控作用,近几年的研究发现C区基因编码的核心抗原可以调控细胞内的基因表达。HBcAg能反式抑制IFN-β基因转录,从而抑制细胞内IFN蛋白的表达;它能反式抑制MXA基因启动子活性,EMSA证明HBcAg与MXA基因启动子有直接相互作用。在我们的前期实验中,我们通过构建HBcAg表达载体并筛选HepG2细胞克隆株进行研究,结果表明HBcAg表现为抑制FasAb及IFNα诱导的HepG2细胞凋亡效应。HBV/P22蛋白含有核心抗原的全部氨基酸序列,因此该蛋白也可能参与抑制细胞凋亡。TNFα在体内主要存在于肝脏中,约占全身30%,TNFα是重症肝炎发病的核心细胞因子之一,但体外研究表明,TNFα诱导肝细胞凋亡需要某些因素协同作用,即TNFα诱发细胞凋亡需要其他因素在转录水平进行阻遏。放线菌素D（Act-D）是一种RNA合成抑制剂,Act-D处理后肝癌细胞对TNFα的刺激变得敏感,从而导致凋亡。有报道HBV/P22蛋白的AA23-73部分与Fas死亡结合蛋白（FADD）的死亡效应区（DED）有23.5%的同源性,FADD是TNFα诱导细胞凋亡的重要通路蛋白,因此HBV/P22蛋白可能通过影响Fas—FasL介导的凋亡途径,从而抑制TNFα诱导的细胞凋亡。本研究通过体内、体外试验较为深入的研究HBV/P22蛋白对肝细胞凋亡的影响。研究目的1、在体外实验中研究HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。2、在体内实验中研究HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα诱导的HepG2瘤体细胞凋亡。研究方法1、鉴定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株稳定表达HBV/P22蛋白:HepG2-pCDNA3.1+、HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株分别以1×106/孔接种于六孔板,3天后收集上清,雅培试剂检测HBeAg表达,HBeAg含量S/CO参考值<2.1为阴性。前述两组细胞株分别取107个细胞裂解,常规方法进行HBV/P22蛋白的Western blot检测。2、HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体外研究:采用流式细胞术及原位末端标记技术（terminal deoxynucleotide mediated nick end labeling TUNEL）检测HBV/P22蛋白影响Act-D、TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。使用终浓度为333nM Act-D及1001μg/L TNFα诱导HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞凋亡,同时以HepG2-pCDNA3.1+细胞作为对照,刺激时间6h后,使用流式细胞术（FlowCytometry,FCM）,利用Annexin V-FITC双染色,检测细胞凋亡率;同样方法培养和诱导细胞凋亡后,丙酮固定,样本通透性处理后,使用TUNEL技术检测细胞凋亡率,DAB显色液显色,倒置显微镜下观察。阳性细胞判断标准:细胞核呈棕黄色染色为阳性,细胞核无棕黄色染色为阴性,随机取5个视野,高倍镜下（400×）观察记数阳性细胞百分率。3、裸鼠动物模型的建立:BALB/c-nu/nu裸鼠16只,随机分为2组。收集培养的HepG2-pCDNA3.1+和HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞,以5×107/0.1ml/site细胞悬液分别注射于裸鼠的颈背部皮下。瘤体积平均值为100mm3左右,利用Act-D、TNFα诱导瘤细胞凋亡,连续用药5天,每天一次。停药后第2天,处死裸鼠,收集瘤体标本,瘤体组织石蜡包埋,组织切片制作及HE染色观察瘤体形态。4、免疫组化检测肿瘤组织HBV/P22蛋白表达:石蜡切片抗原修复后,按免疫组化常规步骤,用HBeAg单克隆抗体检测HBV/P22蛋白表达。DAB显色液显色,倒置显微镜下观察。阳性细胞判断标准:细胞呈棕黄色染色为阳性,细胞无棕黄色染色为阴性。5、TUNEL测定肿瘤组织细胞凋亡率:石蜡包埋的组织切片,按常规方法进行脱蜡、水合、样本通透性处理后,按TUNEL试剂盒操作,DAB显色液显色,倒置显微镜下观察。阳性细胞判断标准:细胞核呈棕黄色染色为阳性,细胞核无棕黄色染色为阴性,随机取5个视野,高倍镜下（400×）观察记数阳性细胞百分率。结果1、鉴定HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株稳定表达HBV/P22蛋白:雅培分析检测示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞培养上清HBeAg表达阳性,对照组为阴性;Western blot检测显示HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞有HBV/P22蛋白表达,对照组为阴性。2、HBV/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体外研究:流式细胞术检测结果显示实验组细胞凋亡率（3.77±0.76）%显著低于对照组（23.31±5.82）%,（t=5.771,P=0.004）;细胞TUNEL检测结果显示实验组细胞凋亡率（7.20±1.25）%显著低于对照组（15.28±1.48）%,（t=9.349,P=0.000）。3、裸鼠动物模型的建立:在饲养及用药过程中,HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞组裸鼠死亡2只,HepG2-pCDNA3.1+细胞组裸鼠死亡3只,每组取5只进行检测,HE染色观察瘤体形态良好。4、免疫组化检测肿瘤组织HBV/P22蛋白的表达:结果显示注射HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株的动物肿瘤组织有较好的HBV/P22蛋白表达,对照组为阴性。5、人肝癌肿瘤组织细胞TUNEL测定:TUNEL检测结果显示接种HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22细胞株的小鼠瘤体组织细胞凋亡率（16.73±1.52）%显著低于对照组（28.42±1.79）%,（t=11.121,P=0.000）。结论HBV/P22蛋白在体内外均可抑制Act-D、TNFα诱导的HepG2细胞凋亡,其抑制HepG2细胞凋亡的机理仍待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 鉴定HBV/P22蛋白在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 第二部分 乙型肝炎病毒/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体外研究
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 第三部分 乙型肝炎病毒/P22蛋白影响HepG2细胞凋亡的体内研究
• 材料和方法
• 结果
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 硕士期间工作
• 致谢