扫描电化学显微术在探测微量蛋白及构建叶酸微阵列中的应用研究

论文摘要

扫描电化学显微术（scanning electrochemical microscopy，SECM）是上世纪八十年代末发展起来的一种新型电化学扫描探针技术。由于其具有化学灵敏度高，空间分辨率好，响应速度快等优点，目前已被应用于酶、抗原/抗体、DNA和细胞等的检测成像，并展示出良好的应用前景。同时，SECM采用各种各样材料和性质的超微电极作为工作探针，不仅提高了检测成像的灵敏度和分辨率，扩大了应用对象的范围，而且由于探针可以按需要在一定区域内自由移动，使得SECM在表面修饰上也显示出强大的实用性。因此，进一步发挥SECM在检测成像和表面修饰上的优势，将之与其它技术方法相结合来拓展其应用研究的领域，解决当前研究中的技术难题，是SECM今后发展的重要方向。本课题利用SECM在检测成像和表面修饰上的优势，结合蛋白银染及点击化学等技术手段，进行了微量蛋白探测及叶酸微阵列构建的探索研究，取得了较好的效果，为SECM技术向食品安全领域的延伸奠定了基础。本文首先利用SECM技术在检测成像上的功能，对凝胶电泳银染后的蛋白条带进行了检测成像。首先以标准BSA蛋白为对象建立了一种SECM探测微量蛋白的方法：将一系列标准浓度的BSA蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过银染手段将蛋白显色，然后利用SECM反馈模式原理对各浓度的蛋白条带进行检测成像，尤其是对不可视微量蛋白的探测。接着利用该方法进行了牛奶中微量过敏原蛋白的探测。研究结果表明：利用反馈模式原理作为银染蛋白条带检测的依据，采用4.2μm半径的Pt探头，在8.4μm的扫描高度下，SECM能检测到10-11g水平的BSA蛋白，同时可以描绘出蛋白条带的形貌特征。利用该方法能检测出牛奶中银染法无法检出的低含量过敏原蛋白，灵敏度高于银染法。本章研究结果表明SECM能作为微量蛋白探测的一种新颖灵敏的方法。本文接着利用SECM技术在表面修饰上的功能，结合点击化学原理，通过SECM探头产生催化剂和其有效移动实现点击化学反应（Click反应）的发生，在石英玻板表面修饰了叶酸微阵列，并将表面功能化叶酸微阵列的玻板进行了白血病细胞K562的捕捉和固定。研究结果表明：结合Salen Cu（Ⅱ）的特殊性质和SECM的电化学特性，能成功地在探头上产生Cu（I）来催化点击化学反应的发生，进而在叠氮端基SAMs玻板上修饰形成几种类型的叶酸微阵列。光学显微镜观察结果显示叶酸微阵列玻板能大致按照阵列的形状有效地对K562细胞进行捕捉和固定，表明了SECM结合点击化学能够成功构建出一定类型的叶酸微阵列。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 扫描电化学显微镜及其特点
• 1.3 实验装置及工作原理
• 1.4 SECM 工作模式
• 1.4.1 反馈模式（Feedback mode）
• 1.4.2 产生/收集模式
• 1.5 SECM 应用研究概述
• 1.5.1 SECM 在检测成像方面的应用
• 1.5.2 SECM 在表面修饰方面应用
• 1.6 本课题的立题背景、意义及其主要研究内容
• 第二章 SECM 探测成像凝胶电泳中的微量蛋白
• 2.1 引言
• 2.2 实验仪器与试剂
• 2.2.1 实验仪器与设备
• 2.2.2 实验材料与试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 相关溶液的配制
• 2.3.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶制备
• 2.3.3 SECM 探测银染蛋白条带的可行性研究
• 2.3.4 BSA 蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5 硝酸银染色
• 2.3.6 SECM 扫描成像银染后的 BSA 蛋白条带
• 2.3.7 牛乳乳清蛋白的制备
• 2.3.8 乳清蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色
• 2.3.9 SECM 探测银染后的乳清蛋白条带
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 SECM 探测成像银染蛋白的模式原理
• 2.4.2 Pt 电极的循环伏安曲线
• 2.4.3 Pt 电极的逼近曲线和探头高度的确定
• 2.4.4 SECM 对银染蛋白点的感应
• 2.4.5 BSA 蛋白的 SDS-PAGE 及银染结果
• 2.4.6 SECM 探测条件的选择
• 2.4.7 BSA 蛋白银染条带的 SECM 扫描图
• 2.4.8 牛奶乳清蛋白的 SDS-PAGE 及染色结果
• 2.4.9 乳清蛋白银染条带的 SECM 扫描图
• 2.5 本章小结
• 第三章 SECM 结合点击化学构建叶酸微阵列
• 3.1 引言
• 3.2 实验仪器与试剂
• 3.2.1 仪器与设备
• 3.2.2 材料与试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 相关溶液配制
• 3.3.2 K562 细胞培养
• 3.3.3 POSS-NH2的制备
• 3.3.4 叠氮端基 SAMs 玻板的制备
• 3.3.5 通过 click 法连接荧光物质表征叠氮端基 SAMs 玻板
• 3.3.6 炔基化叶酸的合成及表征
• 3.3.7 Salen Cu（Ⅱ）的合成及表征
• 3.3.8 SECM 结合点击化学原理在叠氮端基 SAMs 玻板上修饰叶酸微阵列
• 3.3.9 全表面功能化叶酸 SAMs 玻板对白血病细胞 K562 的捕捉
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 叠氮端基 SAMs 玻板 Click 法连接荧光化合物结果
• 3.4.2 炔基化叶酸的表征
• 3.4.3 Salen Cu（Ⅱ）的表征
• 3.4.4 Pt 电极的循环伏安曲线
• 3.4.5 Pt 电极的逼近曲线和探头高度的确定
• 3.4.6 Click 反应修饰叶酸微阵列
• 3.4.7 全表面功能化叶酸 SAMs 玻板对白血病细胞 K562 的捕捉
• 3.4.8 数显微镜观察叶酸微阵列基底对白血病细胞 K562 的捕捉
• 3.5 本章小结
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文