脂肪酶高产菌的筛选及酶学性质和发酵条件研究

论文摘要

从多家植物油厂采集到107份含油土样,以橄榄油为唯一碳源进行富集培养,通过以三丁酸甘油酯为底物的透明圈法和以罗丹明B为显色剂的荧光圈法,筛选到产脂肪酶菌187株。其中一株产酶能力较强,且对20%（v/v）的甲醇溶液有较好的耐受性,将其命名为SXL-107。通过形态观察和ITS序列分析,并构建进化树,初步鉴定SXL-107为Galactomyses geotrichum通过单因素实验对SXL-107进行了初步的发酵条件研究,提高了脂肪酶的产酶能力,发酵液酶活力从初始的15.1U/ml提高到了104U/ml,其中黄豆粉的添加对产酶能力的提高起到了较大的促进作用。经过优化后的培养基成分为:蛋白胨1.0g,蔗糖0.5g,（NH4）2SO41.0g,黄豆粉2.0g,MgSO4·7H2O 0.05g,KH2PO40.15g,橄榄油1mL,H2O100mL。发酵条件为:培养基起始pH为6.0,摇瓶装液量为20ml,接种量为2%,培养温度30℃,培养时间为48小时。以菌种SXL-107的发酵液为初始原料,采用硫酸铵分级沉淀提取了粗酶,发现饱和硫酸铵浓度在30%～70%（25℃）时能除去大部分的杂蛋白,回收率为62%,纯化倍数1.95;采用DEAE-Sepharose FF纯化了SXL-107粗酶,纯化后的SXL-107脂肪酶比活力达到了22500U/g,回收率32%,纯化倍数13.23。对SXL-107脂肪酶进行耐受甲醇实验和酶学性质研究,SXL-107脂肪酶在20%甲醇溶液中作用48h后,剩余相对酶活为96.15%;该酶最适温度和pH分别为40℃和pH7.0,50℃温浴60min仍有80%的酶活力,在pH4.0～9.0间稳定,微量的Mg2+、K+和Zn2+对该酶有激活作用,Mn2+和Co2+有抑制作用,其分子量约为66kDa。本实验筛选到一株耐甲醇能力较强的脂肪酶产生菌,为该酶在生物柴油中的应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章：文献综述
• 1.1 脂肪酶研究进展
• 1.2 脂肪酶的生产
• 1.3 脂肪酶活力的测定方法
• 1.4 脂肪酶的纯化
• 1.5 脂肪酶的应用
• 1.6 研究的目的和意义
• 第二章 脂肪酶高产菌株的筛选，鉴定及发酵条件的优化
• 引言
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 富集培养
• 2.2.2 初筛培养
• 2.2.3 复筛培养
• 2.2.4 脂肪酶活力的测定
• 2.2.5 高产菌株的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产脂肪酶菌的分离
• 2.3.2 产脂肪酶菌SXL-107 的鉴定
• 2.3.3 菌株SXL-107 产酶条件的优化
• 2.4 小结
• 第三章 脂肪酶的分离纯化及其性质研究
• 引言
• 3.1 材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液的制备
• 3.2.2 脂肪酶的分离纯化
• 3.2.3 酶活力的测定
• 3.2.4 SDS-PAGE 电泳分析
• 3.2.5 SXL-107 脂肪酶酶学性质的研究
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 脂肪酶的分离纯化结果
• 3.3.2 SXL-107 脂肪酶酶学性质
• 3.4 小结
• 第四章 全文总结及讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究生期间所发表的文章