论文摘要
辅酶不足是限制大多数氧化还原酶进行生物催化合成产物的主要因素,氧化还原酶催化合成的产物被广泛应用于医药、食品、农药等领域,因此,研究加强辅酶再生具有非常重要的学术意义和经济价值。关于黑根霉生物转化甾体C11α-羟基化的研究己有近几十年,生产技术相对较成熟,所以在现有研究基础上继续提高转化率比较困难。黑根霉内细胞色素P450酶系是催化甾体C11α-羟基化主要催化剂,催化过程需要持续提供NADPH保证催化反应的进行,根据目前的理论研究,造成生产中转化率难以继续提高的主要原因很可能是酶催化过程中辅酶NADPH的限制。因此本论文从加强辅酶NADPH再生出发,研究将G6PDH克隆至黑根霉中考察对甾体C11α-羟基化的影响。所以,本论文首先从米根霉中分离到G6DPH基因片段。通过Trizol法提取米根霉总RNA,利用RT-PCR手段获得了G6PDH基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果显示,G6PDH大小在1200-1400bp,与BROAD数据库中报道的大小1346bp相符,将G6PDH片段与PMD19-T连接进行感受态细胞转化,菌落PCR和酶切验证筛选出阳性克隆进行测序鉴定,鉴定结果与报道序列一致。限制性内切酶BamHⅠ和Apa Ⅰ双酶切获得带有相同粘性末端的G6PDH片段和质粒载体PCB1004,构建了真菌表达载体PCB1004-G6PDH。其次,研究制备了黑根霉原生质体并进行PEG介导的原生质体转化。原生质体制备最佳条件为6%溶壁酶（Lywallzyme）和8%Yaal-ase,30℃,酶解4 h；潮霉素敏感性试验建立了筛选的抗性浓度为200μg/ml;PEG介导的原生质体转化筛选到了两株G6PDH基因工程菌RG3和RG12,从基因组DNA水平上进行验证,验证结果表明RG3和RG12基因组中都整合了编码潮霉素B磷酸转移酶基因（HPH）和G6PDH目的基因。通过单因素试验初步考察了黑根霉原始菌株、筛选的RG3和RG12两株工程菌在不同碳源、有机氮源、无机氮源中的生长情况以及催化转化沃氏氧化物转化率,结果表明：最佳碳源和最佳有机氮源都分别为葡萄糖和黄豆饼粉,碳源中橄榄油对RG12的转化率影响非常显著,以葡萄糖和橄榄油作为碳源时转化率分别为14.3±0.70%和28.5±0.500%,表明橄榄油对催化过程具有促进作用,这对继续优化RG12提高转化率具有重要的依据；无机氮源对转化率的影响试验表明,无机氮源的添加明显不利于原始菌株对沃氏氧化物的转化,而对于RG3,添加硝酸钠后转化率有所提高,达到了48.75±0.70%,对于RG12,添加磷酸二氢铵后转化率相对提高,达到45.55%±0.42%,相比原始菌株试验后的最高转化率41.69±0.90%,工程菌在对沃氏氧化物羟基化应用中具有优势,证明了G6PDH在提高菌体对甾体C11α-羟基化能力中具有很大的潜力和应用价值。
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标签：黑根霉论文; 葡萄糖磷酸脱氢酶论文; 羟基化论文; 甾体羟基化论文;