糖尿病时程及血糖控制对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及机制

论文摘要

背景和目的2010年N Engl J Med报道，中国糖尿病（diabetes mellitus, DM）患病率逐年升高，全国已有超过9240万DM患者，此外尚有约1.47亿人处于DM前期。我国已经超过印度成为DM第一大国。心血管并发症是DM患者的“头号杀手”，65%的DM患者死于心血管意外，DM及其继发心血管疾病已经成为威胁公众健康的严重问题。大量研究显示，DM患者的心绞痛、心肌梗死和充血性心力衰竭的发病率显著提高，发病程度更加严重。DM动物模型也显示，DM小鼠行I/R（ischemia/reperfusion，I/R）损伤后其梗死面积增加，心功能降低。这些研究表明，DM心肌对缺血性损伤的易损性增加。但是，与这些结果相反，有研究发现，在使用心肌酶谱和QRS评分来评估心肌梗死面积时发现，DM患者的心梗面积与非DM患者相似甚至更小。动物模型的研究显示，DM小鼠心肌I/R后，其心肌收缩能力反而比非DM小鼠强。我们对现有DM心肌对缺血性损伤耐受性的研究进行分析后发现，得出DM心肌对缺血性损伤耐受性增加的研究，其DM动物的DM时程较短；而得出DM心肌对缺血性损伤耐受性降低的研究，其DM动物的DM时程则较长。因此，我们假设，DM的时程可能是造成上述在DM心肌对缺血性损伤易感性方面得出相反结论的原因之一。氧化/硝化应激在DM及其并发症的发生、发展中起着关键作用。氧化/硝化应激产物RNS（reactive nitrative species）以及ROS（reactive oxidativespecies）也是心肌缺血性损伤的重要调节因子。RNS和ROS产物过氧化亚硝基根（ONOO-，NO与O2-反应产物）可以使蛋白质酪氨酸残基发生硝基化，这种蛋白质的硝基化修饰可以在机体生理、病理信号通路中发挥关键的作用。硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）是一种在所有细胞中广泛表达的小分子蛋白。Trx不仅参与体内抗氧化过程，而且参与细胞凋亡的调控，Trx的酪氨酸残基可以被硝基化，导致Trx活性消失。大量研究表明，DM心肌中硝基酪氨酸水平增加；且这种硝基化应激导致的Trx硝基化失活可能是DM心肌对缺血性损伤易损性增加的原因之一。然而，DM时程与DM心肌氧化/硝化应激以及Trx硝基化失活之间的关系以及由此对DM心肌缺血性损伤的影响仍不得而知。强化血糖控制可使DM患者发生微血管并发症的风险显著降低，但对于大血管并发症的影响仍然存在许多争论。UKPDS研究显示，与常规治疗组相比，强化治疗可使任何DM相关终点的相对风险降低，这种风险降低最主要是由于微血管并发症的风险降低，但是心肌梗死的风险却未下降。ACCORD研究发现，强化降糖患者其非致死性心肌梗死、非致死性脑卒中及心血管原因死亡的复合终点事件反而增加。但是DIGAMI研究结果表明，采用胰岛素控制急性冠脉综合征患者的高糖血症能降低其全因死亡率。因此，血糖控制与DM心肌的保护之间的关系仍待阐明。更重要的是，血糖控制对DM心肌缺血性损伤的影响机制更是不得而知。因此，本研究拟通过动物模型：1)阐明DM时程与心肌I/R损伤之间的关系，即是否DM心肌I/R损伤呈时间依赖性加重；如果此结论成立进一步阐明其机制是否与DM心肌氧化/硝化应激及由此导致的Trx硝基化失活有关。2)阐明血糖控制对DM心肌I/R损伤的影响；如果血糖控制具有心肌保护作用，则进一步阐明这种保护作用是否与血糖控制降低DM心肌氧化/硝化应激及由此导致的Trx硝基化失活有关。实验一：小鼠DM模型及I/R模型的建立：1、腹腔注射链脲佐菌素（STZ，以0.1mol/L柠檬酸缓冲液溶解），剂量为40mg/kg体重；对照组注射等量柠檬酸缓冲液。连续注射5天。2、用异氟烷吸入法麻醉小鼠后，开胸暴露心脏，采用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支距根部2-3mm处打一活结造成心肌缺血，30min后，将活结打开进行再灌注。实验二：小鼠DM时程对I/R损伤的影响及机制：小鼠分别在建立DM模型1天（DM1d）, 7天（DM7d）,14天（DM14d）后进行I/R，以相同年龄的非DM小鼠为对照。再灌注3h后心肌分别检测以下指标：心肌细胞凋亡，caspase-3活性，总NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量，Trx活性，Trx硝基化水平；再灌注24h后用于检测心梗面积以及LDH含量。实验三：血糖控制对小鼠心肌I/R损伤的影响及机制：小鼠在建立DM模型后第1天、第7天、第14天分别给予胰岛素治疗（10U/kg体重/d），分别治疗14天、7天、1天；在结束胰岛素治疗的第2天行I/R，为了去除胰岛素本身的心肌保护作用，胰岛素治疗14天小鼠在行缺血前10min给予额外的PI3K抑制剂wortmannin（阻断胰岛素的信号通路）腹腔单次注射（10μg/kg体重）。再灌注3h后心肌分别检测以下指标：心肌细胞凋亡，caspase3活性，总NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量，Trx活性，Trx硝基化水平；再灌注24h后用于检测心梗面积以及LDH含量。结果1、小鼠DM及I/R模型的建立连续腹腔注射STZ 5天，观察2天后，鼠尾取血采用罗氏血糖仪及配套试纸测定血糖。空腹血糖高于11.1mmol/L且出现典型的DM“三多一少”（多饮，多尿，多食，体重减轻）症状，DM模型制备成功。小鼠行I/R后，其心肌经过伊文氏蓝/TTC双染后分别呈现白色、红色及蓝色，分别代表梗死区、缺血区域及正常区域，证明模型建立成功。2、小鼠DM时程对I/R损伤的影响及机制与对照组相比，DM1d组I/R损伤（心梗面积和LDH含量）、心肌细胞凋亡（TUNEL染色、caspase-3活性）无统计学差异，氧化/硝化水平（总NO含量，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量），Trx活性及硝基化水平与对照组相比也无统计学差异；随着DM时程增加，DM7d组I/R损伤、心肌细胞凋亡、氧化/硝化水平、Trx硝基化水平增加，Trx活性降低，与对照组及DM1d组相比均有统计学差异（P均<0.05）；DM14d组I/R损伤、心肌细胞凋亡、氧化/硝化水平、Trx硝基化水平进一步增加，而Trx活性进一步降低，与对照组及DM7d组相比均有统计学差异（P分别<0.01以及<0.05）。3、血糖控制对小鼠心肌I/R损伤的影响及机制与安慰剂组（Vehicle）相比，Insulin 1组（胰岛素治疗1天）对血糖无影响；Insulin 7组（胰岛素治疗7天）及Insulin 14组（胰岛素治疗14天）血糖明显降低（P分别<0.05及0.01）。与安慰剂组（Vehicle）相比，Insulin 1组（胰岛素治疗1天）DM心肌I/R损伤、硝基酪氨酸水平、Trx活性无变化，差异无统计学意义。随着治疗时程增加，与Vehicle相比，Insulin 7 （胰岛素治疗7天）、Insulin 14 （胰岛素治疗14天）与安慰剂组（Vehicle）相比，心肌I/R损伤、硝基酪氨酸水平降低，Trx活性增加，差异有统计学意义（所有P<0.05）；且Insulin 14治疗效果优于Insulin 7，差异有统计学意义（所有P<0.05）。为进一步排除胰岛素本身对心肌的保护作用，Insulin 14组给予Wortmannin阻断胰岛素信号。与Insulin 14相比，Insulin 14+Wortmannin组心肌细胞凋亡增加，但是与Vehicle组相比，Insulin 14+Wortmannin组心肌细胞凋亡仍降低（P<0.05）。与Insulin 14相比，Insulin 14+Wortmannin组心肌I/R损伤、心肌细胞凋亡、氧化/硝化水平、硝基化水平虽然有增加趋势，Trx活性有降低趋势，但是无统计学差异。结论1. DM心肌I/R损伤与其时程呈正相关，随着DM时程增加，I/R损伤加重，并且这种相关性与氧化/硝化应激引起的Trx硝基化失活有关。2、小鼠DM时程对I/R损伤的影响及机制2.血糖控制能够减轻DM心肌I/R损伤，且血糖控制越严格获益越明显，其机制跟血糖控制能够减轻氧化/硝化应激，从而减少Trx的硝基化有关。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1、DM及其继发心血管疾病已经成为威胁公众健康的严重问题
• 2、DM患者心血管事件发生率高，但有关DM心肌对缺血损伤易感性研究的结果却存在争议
• 3、DM时程可能是影响DM心肌对缺血性损伤敏感性的因素，但未被证实
• 4、引起DM心肌对缺血性损伤敏感性改变的机制很多，但不能解释在DM发生、发展过程中DM心肌对缺血性损伤反应性的变化
• 5、氧化/硝化应激是DM心肌对缺血性损伤敏感性增加的原因，但是氧化/硝化应激与DM时程的关系以及由此对DM心肌缺血性损伤的影响仍不清楚
• 6、Trx硝基化失活是DM心肌缺血性损伤加重的原因，但Trx硝基化失活与DM时程的关系以及由此对心肌缺血性损伤的影响仍不清楚
• 7、强化血糖控制可使DM患者发生微血管并发症的风险显著降低，但对于大血管并发症的影响仍然存在许多争论，更重要的是强化血糖控制对心血管事件影响的机制仍不清楚
• 8、用胰岛素强化控制血糖治疗可以降低DM心血管死亡率，但这种益处是来源于胰岛素还是血糖控制本身仍不清楚
• 第一部分 动物模型的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第二部分 糖尿病时程对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及可能的机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 血糖控制对糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及可能的机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢