黄酮及磷酰化黄酮抗肿瘤作用及其机理研究

论文题目: 黄酮及磷酰化黄酮抗肿瘤作用及其机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 有机化学

作者: 张婷

导师: 赵玉芬

关键词: 黄酮,磷酸酯,细胞,增殖,分化,凋亡,蛋白表达,弱相互作用,小牛胸腺,细胞信号转导

文献来源: 郑州大学

发表年度: 2005

论文摘要: 由于磷在生命过程中具有的中心地位和作用，本论文在赵玉芬教授“磷生命化学”思想指导下，选择一系列有生物活性的肽类、核苷、蛋白质、药物和天然产物为先导化合物，对其官能团进行磷酰化结构改造(以改变其活性或达到仿生作用)，构建了一个“磷酰化化合物分子库”，对生物体系进行了干预研究。选择具有抗肿瘤作用的新化合物磷酰化黄酮，包括7-羟基黄酮(HF)及其磷酸酯(FP)，白杨素(CR)的7位一磷酸酯(CPE和CPI)及其5，7二位二磷酸酯(CP)，7-羟基-4’-氟异黄酮(HFF)及其磷酸酯(PFF)，以及7-羟基-4’-氯异黄酮(HFCl)及其磷酸酯(PFCl)，首次对其进行了抗肿瘤方面的研究，并与未改造的黄酮进行了对比。本论文从两个平面进行了研究，首先从细胞平面，利用细胞生物学和分子生物学的技术及流式细胞技术，用系列磷酰化黄酮和黄酮作用于Hela肿瘤细胞培养体系，对其抗肿瘤作用及其机理进行探讨，并根据其结构特点，初步验证了磷酰化黄酮抗肿瘤作用活性增强的分子结构基础；进一步从细胞外分子水平，利用生物化学、有机化学和化学生物学等研究手段研究磷酰化黄酮和黄酮分别与大分子蛋白(单体或多元体系)和核酸之间的弱相互作用，来探讨生物体内磷酰化黄酮和黄酮具有不同作用的分子机制，这些工作对于磷在生命体内的重要作用提供了更加充实的细胞分子水平方面的证据，为磷酰化黄酮作为将要开发的潜药提供了实验依据，也为药物分子的改造提供了基础理论支撑。本研究分为四个部分：系列黄酮及其磷酸酯的抗肿瘤作用初步研究；黄酮及磷酰化黄酮抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡作用研究；黄酮及其磷酰化黄酮对细胞核蛋白表达和细胞信号转导分子元件的研究；荧光、

论文目录:

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 肿瘤治疗作用靶点与抗肿瘤药物设计

1.1.1 增殖失控与肿瘤治疗

1.1.2 诱导分化与肿瘤治疗

1.1.3 细胞凋亡与肿瘤治疗

1.2 黄酮类化合物抗肿瘤作用

1.2.1 黄酮类化合物抗细胞增殖作用

1.2.2 黄酮类化合物干预细胞信号转导

1.2.3 黄酮类化合物诱导细胞凋亡

1.2.4 黄酮类化合物促进抑癌基因表达和抑制癌基因表达

1.3 天然活性小分子抗肿瘤作用研究常用技术和方法

1.3.1 生物学和分子生物学常用的技术

1.3.2 流式细胞技术(flow cytometry FCM)

1.3.3 凋亡常用的检测方法

1.3.4 流式细胞术分析对凋亡的检测

1.3.4.1 细胞凋亡早期反应检测

1.3.4.2 细胞凋亡晚期检测

1.3.5 生物质谱技术

1.4 化学生物学重要研究方向

1.4.1 采用小分子活性化合物作为探针,探索和控制细胞过程

1.4.2 生物体系的小分子调控中,分子识别和分子间相互作用的化学基础研究

1.4.3 生命科学中有机化学发展前沿及研究热点

1.5 以磷为中心的天然活性小分子的改造

1.6 博士论文的设计思路和研究内容

1.6.1 博士论文的设计思路

1.6.2 具体研究内容和方案

1.6.3 本研究的创新性

参考文献

第2章 系列黄酮及其磷酸酯的抗肿瘤作用初步研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器设备

2.2.2 细胞株

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要溶液的配制

2.2.5 实验方法

2.2.5.1 细胞培养与实验分组

2.2.5.2 MTT法测定化合物对Hela细胞生存能力的影响

2.3 结果和讨论

2.3.1 HF、FP、CR和CP对Hela细胞存活的影响

2.3.2 HF、FP、CR和CP对CNE细胞存活能力的影响

2.3.3 HF、FP、CR和CP对小鼠成纤维细胞存活的影响

2.3.4 磷酰化的氨基酸对Hela细胞存活的影响

2.3.5 CR、CP、CPE和CPI对Hela细胞存活的影响

2.3.6HFF,PFF,HFCl和PFCl对Hela细胞存活的影响

2.3.7 CR、CP、CPE和CPI对CNE细胞存活能力的影响

2.3.8 系列黄酮及其磷酰化黄酮抗肿瘤构效关系探讨

2.4 结论

参考文献

第3章 黄酮及磷酰化黄酮抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡作用研究

3.1 前言

3.1.1 肿瘤的诱导分化研究已有的工作基础

3.1.2 肿瘤治疗与细胞凋亡

3.1.3 TUNEL简介

3.1.4 本章研究目的

3.2 实验部分

3.2.1 仪器设备

3.2.2 细胞株

3.2.3 主要试剂

3.2.4 主要溶液的配制

3.2.5 实验方法

3.2.5.1 细胞培养与实验分组

3.2.5.2 软琼脂克隆形成率测定

3.2.5.3 增殖细胞比率记数

3.2.5.4 流式细胞仪测细胞周期

3.2.5.5 TUNEL法测定细胞凋亡

3.2.5.6 细胞膜通透性的改变Heochst33342单染法

3.2.5.7 Heochst33342／PI双染法

3.3 结果

3.3.1 HF／FP及CR／CP／CPE对Hela细胞生长的影响

3.3.2 HF／FP及CR／CP／CPE对Hela细胞软琼脂集落形成能力的影响

3.3.3 增殖细胞比率记数

3.3.4 HF、FP、CR、CP和CPE组对Hela细胞的细胞周期影响

3.3.5 HF、FP、CR、CP和CPE组对Hela细胞凋亡的影响

3.3.5.1 HF、FP、CR、CP和CPE组对Hela细胞早期凋亡的检测

3.3.5.2 Heochst33342／PI双染流式细胞检测凋亡结果

3.3.5.3 TUNEL对Hela细胞凋亡的检测

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

第4章 黄酮及其磷酰化黄酮对细胞核蛋白表达和细胞信号转导分子事件的研究

4.1 前言

4.1.1 核基质概述

4.1.1.1 核基质结构和功能

4.1.1.2 核基质的组成反映细胞的表型及分化状态

4.1.2 PCNA概况

4.1.2.1 PCNA的分子结构与功能

4.1.2.2 PCNA与肿瘤

4.1.3 p21WAF1概况

4.1.3.1 p21WAF1／Cip1／Sdi1的发现和命名

4.1.3.2 p21的结构和功能

4.1.3.3 p21蛋白在肿瘤演进过程中的作用

4.1.4 cAMP-蛋白激酶信号途径

4.1.5 酪氨酸蛋白激酶TPK

4.1.6 本章研究的目的

4.2 实验材料和方法

4.2.1 仪器设备

4.2.2 实验试剂

4.2.3 主要溶液的配制

4.2.3.1 核蛋白提取试剂Western Blot试剂

4.2.3.2 Western Blot试剂

4.2.3.3 核基质提取试剂

4.2.3.4 核基质电泳试剂

4.2.3.5 125IcAMP RIA Kit试剂

4.2.4 细胞培养与实验分组

4.2.5 细胞核基质的提取和电泳

4.2.6 细胞核蛋白的提取

4.2.7 Western blotting测p21WAF1的表达

4.2.8 PCNA免疫组化技术

4.2.9 环腺苷酸(cAMP)的提取和测定

4.2.10 统计学方法

4.3 结果

4.3.1 HF、FP、CR、CP和CPE对核基质的影响

4.3.2 HF、FP、CR、CP和CPE对核蛋白的影响

4.3.3 PCNA蛋白的表达

4.3.4 HF、FP、CR、CP和CPE对Hela细胞对p21／WAF1蛋白表达的影响

4.3.6 HF、FP、CR、CP、CPE对TPK表达的mRNA的影响

4.4 讨论

4.5 结论

参考文献

第5章 羟基黄酮及其磷酸酯对钙调素-磷酸二酯酶体系和DNA弱相互作用的质谱荧光研究

5.1 磷酸化黄酮FP干预Ca~(2+)-CaM-PDE-Ⅰ体系相互作用的荧光研究

5.1.1 前言

5.1.1.1 cAMP的降解及Ca~(2+)-CaM-PDE-Ⅰ体系

5.1.1.2 体外观察FP对Ca~(2+)-CaM-PDE体系干预研究内容

5.1.2 主要仪器和试剂

5.1.3 实验方法

5.1.4 结果和讨论

5.1.5 FP对Ca~(2+)-CaM-PDE体系作用类型

5.1.5.1 结合常数K的计算

5.1.5.2 作用力类型的确定

5.1.5.3 荧光静态淬灭

5.1.6 小结

5.2 FP-Ca~(2+)-CaM弱相互作用ESI质谱研究

5.2.1 引言

5.2.2 仪器与试剂.

5.2.3 结果和讨论

5.2.4 结论

5.3 黄酮及其磷酰化黄酮对DNA荧光研究

5.3.1 前言

5.3.2 主要仪器与试剂

5.3.3 结果和讨论

5.3.3.1 HF和FP对DNA-EB相互作用的荧光研究

5.3.3.2 Scatchard图实验

5.3.4 小结

5.4 结论

参考文献

第6章 总结

致谢声明

附录1 论文图表索引

附录2 缩略语表

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发布时间: 2006-10-10

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