论文摘要
目的:探讨临床治疗血浓度下三种不同作用机制止惊药物（ACs）-苯巴比妥（PB）、苯妥英（PHT）、MK-801-诱导健康新生大鼠脑内过度凋亡的上游机制,并观测由此带来的远期认知功能改变。方法:P5 SD大鼠随机分为7组:重症抢救剂量组:PB100、PHT100、MK1;常规止惊剂量组:PB50、PHT50、MK0.5;以及正常对照（Cont）,每组32只大鼠。一日一次腹腔给药,连续3天。其中24只在停药后次日处死观察脑组织病理学改变（HE、Nissl染色）,以及凋亡相关的TUNEL阳性细胞、Bax和Bcl-2蛋白含量、Caspase-3活性、细胞色素C荧光、氧化-抗氧化状态、Ca2+浓度。余下大鼠于停药5周后采用Morris水迷宫,CaMKⅡ蛋白含量及Golgi染色测试远期认知功能状态。结果:①无论重症或常规剂量ACs使用,均可引起大鼠脑重非常显著性降低（P﹤0.001）,即使排除体重因素影响后仍存在重症用药组脑重下降显著（P﹤0.05）。②ACs尤其重症剂量用药后可见HE、Nissl染色大量神经细胞变性、坏死,Nissl体减少,甚至神经元丢失。③TUNEL阳性细胞计数发现常规/重症ACs组凋亡细胞数分别较对照增高2.55倍和36倍。两种剂量间增幅达显著性差异（P﹤0.05）。④施用不同剂量ACs后,各组大鼠脑Bax蛋白含量显著性增高,而Bcl-2含量轻微降低,进而导致Bax/Bcl-2比值较对照增加51%92%（常规用药）和140%180%（重症用药）。两者对应增幅比较差异显著（P﹤0.05）。⑤常规剂量组Caspase-3活性和细胞色素C荧光强度分别是对照的3.735.08倍和3.223.56倍,重症剂量组更是多达5.296.97倍和4.134.86倍,均显示剂量依赖性。⑥短程ACs用药后线粒体SOD活性及GSH含量均较正常对照非常显著降低,MDA含量同步性显著增高,且都以重症剂量异常幅度更大。⑦即使常规止惊剂量用药也引起神经细胞胞浆和线粒体Ca2+浓度22%36%的增高,重症剂量更是增高显著,在胞内达50%60%,线粒体更达80%90%。⑧远期认知功能及组织学测试显示:虽然各ACs组远期HE和Nissl染色与正常脑片并无区别,但其水迷宫寻台潜伏期自次日起显著延长（P﹤0.001）,越台次数明显减少（P﹤0.001）,Golgi染色树突减少、缩短、变细,以及CaMKⅡ蛋白含量显著性降低。各种改变皆以重症剂量更为突出。结论:⑴短程治疗剂量PB、PHT和MK-801使用,不仅引起健康新生大鼠脑内广泛性过度凋亡,也对认知功能发育造成持久不良影响。其损伤程度具有明显剂量依赖性。⑵ACs所致未成熟脑内过度凋亡主要经由内源性途径（即线粒体途径）发生。⑶线粒体钙超载和/或氧化应激和线粒体功能障碍均可能是ACs诱导凋亡发生的关键性启动因素。目的:对比观察钙通道阻滞剂氟桂利嗪（Flu）和氨氯地平（Aml）对PB、PHT、MK-801未成熟脑损伤的防治效果,以及探讨线粒体钙超载在ACs诱导未成熟脑内过度凋亡中的确切作用与地位。方法:P5 SD大鼠随机分为Flu用药组和Aml用药组,各组再分为联合重症剂量组(即+PB100、PHT100或MK1)和联合常规剂量组(即+PB50、PHT50或MK0.5)。每组8只大鼠,分别在予Flu 30 mg/kg或Aml 3mg/kg灌胃1 hr后,腹腔注射重症抢救剂量或常规剂量PB、PHT和MK-801,连续3天。于次日,断头留取脑标本,观察各项检测指标（同第一部分）。结果:①显著不同于单用ACs,联用钙通道阻滞剂后实验鼠体重、脑重均与正常对照不再显著性差异。②HE、Nissl染色可见Flu及Aml联合常规ACs组神经细胞形态与正常无明显区别。尽管联合重症ACs组仍存在部分形态异常的神经细胞,但较单用大剂量ACs比,其数量明显较少,分布更散在。③青春期组织学观察及认知功能测试表明:联合用药5周后,HE、Nissl染色不再显示形态学改变。类似,Flu / Aml无论联用常规剂量或重症剂量ACs,各组大鼠水迷宫寻台潜伏期均较单用对应ACs显著缩短（P﹤0.05,或﹤0.01）,越台次数明显增加（P﹤0.01或﹤0.001）;Golgi染色树突更长,更粗,分支更多;CAMKⅡ蛋白含量显著性增加（P﹤0.05或﹤0.01）。④与单用ACs比,钙通道阻滞剂使用后Capsase-3活性、细胞色素C荧光强度、以及TUNEL阳性细胞数分别减少超过50%,38% 60%和60%,皆达到非常统计学差异。⑤钙通道阻滞剂和ACs联用后,Bax蛋白含量显著降低,Bcl-2蛋白含量基本恢复正常。进而Bax/Bcl-2比值在Flu+常规ACs组与正常对照不再显著性差异,在Flu / Aml+重症ACs组分别降低41.4% 44.6%和35%37.8%。⑥无论联用Flu或Aml,此两种药物均明显改善被ACs抑制的SOD活性,GSH含量以及过度增加的MDA含量。⑦钙通道阻滞剂（Flu和Aml）均显著降低ACs所致胞浆内及线粒体钙超载程度,且以线粒体下降更明显。⑧各项检测均显示Flu在防治ACs未成熟脑损伤疗效上优于Aml。特别是在水迷宫表现,Bax/Bcl-2比值,Caspase-3活性,以及细胞色素C荧光上,两药对应组间的差异皆达到统计学意义。结论:⑴钙通道阻滞剂Flu（T型）和Aml（L型）可显著减轻PB、PHT及MK-801引起的新生鼠过度凋亡性脑损伤。且多方面均显示Flu的防治功效较Aml更为突出。⑵线粒体Ca2+超载与氧化应激状态的显著缓解以及线粒体功能正常化,是钙通道阻滞剂Flu / Aml阻止ACs诱导过度凋亡的重要分子生物学基础。⑶联用Flu和Aml后线粒体内Ca2+浓度的降低幅度远较胞浆明显,表明消除线粒体Ca2+超载应是钙通道阻滞剂对抗ACs诱导脑内过度凋亡的关键性启动环节。目的:对比观察抗氧化剂依达拉奉（Eda）和褪黑素（Mel）对PB、PHT、MK-801未成熟脑损伤的防治效果,并探索氧化应激反应在ACs脑损伤机制中的具体地位。方法:P5 SD大鼠随机分为Eda用药组和Mel用药组,各组再分为联合重症剂量组(即PB100、PHT100和MK1)和联合常规剂量组(即PB50、PHT50和MK0.5)。每组8只大鼠,分别在予Eda 3 mg/kg或Mel 5mg/kg腹腔注射5 min后,再予重症抢救剂量或常规剂量PB、PHT或MK-801,连续3天。于次日断头留取脑标本,观察各项检测指标（同第一部分）。结果:①联用抗氧化剂后,各ACs组的体重,脑重仍非常显著性减低（P﹤0.001）,甚至在Mel组表现更突出,但去除体重因素后未再发现脑重的显著下降。②较单用ACs比,Eda或Mel组大鼠HE、Nissl染色均显示异常神经细胞数量更少,分布更分散。③青春期组织学观察和认知测试:与停药5周后HE、Nissl染色未见形态学改变一致,各抗氧化剂组寻台潜伏期较单用ACs显著缩短,穿越平台次数明显增加,Golgi染色树突更长,更粗,分支更多,以及CaMKⅡ蛋白含量显著性增加。④Eda / Mel无论联合何种剂量ACs,其Bax蛋白含量均较单用ACs降低43.4% 62.7%,Bcl-2蛋白轻微增加,进而Bax/Bcl比值非常显著下降（P﹤0.001）。⑤各抗氧化剂组大鼠Caspase-3活性,细胞色素C荧光强度分别从单用ACs增高的2.75.0倍和1.32.9倍降低到0.571.4倍和0.41.3,以及TUNEL阳性细胞数减少51.4%59.6%。⑥联用抗氧化剂后,被单用ACs显著抑制的SOD和GSH以及过度增加的MDA均恢复到正常水平。⑦与钙通道阻滞剂功效相反,Eda和Mel均未能使胞浆和线粒体内钙浓度有显著性降低。⑧各项检测指标均未显示Eda与Mel在防治ACs未成熟脑损伤疗效的区别。结论:⑴联用Eda或Mel后,各ACs组的SOD、GSH和MDA等氧化应激指标,全部回返至正常范围,充分显示两药突出的抗氧化性能。⑵在显著抗氧化作用基础上,Eda和Mel均显示显著抑制相关ACs诱发新生大鼠脑内广泛过度凋亡功效,且两者在疗效上未显示明显差异。⑶联合施以ACs和抗氧化剂后,伴随脑内超氧化状态和线粒体功能的基本正常化,却未见胞内和线粒体内钙超载的任何改善。提示线粒体超氧化及其功能障碍,可能是独立于钙超载启动凋亡的另一源头。目的:观察线粒体营养剂（MN）对PB、PHT、MK-801未成熟脑损伤的防治作用。方法:P5 SD大鼠随机分为6组,分别为MN （包括复合维生素B、维生素E、维生素C、左旋肉碱和辅酶Q10）联合重症剂量组(即PB100、PHT100和MK1)和MN联合常规剂量组(即PB50、PHT50和MK0.5)。每组8只大鼠,在分别予MN灌胃1 hr后,腹腔注射重症抢救剂量或常规剂量PB、PHT和MK-801,连续3天。次日,断头留取脑标本,观察各项检测指标（同第一部分）。结果:①显著不同于单用ACs,MN联合ACs后实验鼠体重、脑重均与正常对照不再显著性差异。②较单用ACs比,MN组大鼠HE和Nissl染色均显示异常神经细胞数量更少,分布更分散。③青春期组织学观察和认知测试可见:与停药5周后HE、Nissl染色未见形态学改变一致,联用MN的各组大鼠较单用ACs寻台潜伏期显著缩短,穿越平台次数明显增加,Golgi染色树突更长,更粗,分支更多,以及CaMKⅡ蛋白含量显著性增加。④MN联用后,常规剂量组的Bax、Bcl-2含量均恢复正常。尽管重症剂量组仍存在部分异常,但较单用药比,其Bax含量降低54.1% 63.2%,Bcl-2含量增加60.4%～65.0%,进而Bax/Bcl-2含量下调67.3%73.4%。⑤MN+ACs用药组Caspase-3活性和细胞色素C荧光强度均较单用药降低达91.6%93.3%和74.5%77.9%,其TUNEL阳性细胞数减少72%74%。⑥同抗氧化剂作用一致,MN使用后各ACs组SOD活性,GSH和MDA含量均与正常对照不再显著差异。⑦不同于钙通道阻滞剂使用,联用MN后的各组胞浆和线粒体Ca2+浓度未见显著降低。结论:⑴MN在防治ACs未成熟脑损伤方面疗效突出,较单一抗氧化剂或钙通道阻滞剂更显著地降低PB、PHT和MK-801三种ACs所致新生大鼠神经细胞广泛性过度凋亡。⑵MN除能抑制由ACs引起的线粒体超氧化外,更突出的表现在显著减少线粒体细胞色素C外溢和Caspase-3活化,有效维护线粒体分子结构和功能完整性。⑶MN因由多种营养素组合,可能是其较单一抗氧化剂或钙通道阻滞剂有更好功效的原因,有必要进一步探索针对性更强的“新生儿线粒体营养套餐”。
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