应用液质联用法监测阿霉素在亚细胞组分中的分布及代谢

论文摘要

近年来,阿霉素（Doxorubicin, DOX）被广泛应用于急、慢性白血病,淋巴瘤以及各种实体瘤的治疗过程中,然而它的临床使用因其心脏毒性的出现而受到了很大的限制。对于DOX心脏毒性的产生机制,目前存在很多假说,其中的一种主要观点认为是DOX在体内的代谢产物导致了其心脏毒性的产生。然而至今为止,DOX细胞内代谢途径的机制还没有得到清楚的阐明。为了更加详细的阐明DOX的代谢途径,我们发展了一种液质联用（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC/MS/MS）的分析方法同时测定亚细胞组分内的DOX及其主要代谢物阿霉素醇（Doxorubicinol, DOXo1）的水平。通过固相萃取,将细胞样品纯化和富集,进行方法学的验证,DOX及DOXol的线性范围分别为5.00-1000 ng/mL和0.50-50.0 ng/mL。应用建立的分析方法,比较了两种T淋巴细胞（Jurkat和CCRF-CEM）里全细胞内、细胞核部分及亚细胞部分的DOX及DOXol的分布情况。同时,采集DOX及代谢产物在初步分离的亚细胞组分中的“量—时”变化数据,监测DOX亚细胞代谢水平变化。DOX及DOXol在亚细胞组分内的分布不同及量-时曲线的差异可能归因于不同细胞里代谢酶的表达水平,代谢活性的不尽相同。利用免疫磁性的分离方法,进一步分离了线粒体、酸性细胞器等亚细胞组分,并应用蛋白免疫印迹（Western-blotting）方法对分离组分进行了纯度、回收率和完整性验证。我们将一抗（Anti-voltage-dependent anion-selective channel 1,anti-VDAC1）与初步分离的亚细胞组分混合,它能够特异性识别吸附靶细胞器线粒体表面的特征抗原,再与包被有二抗的磁珠结合,形成磁珠-线粒体的复合物,最后在磁力作用下,即可将线粒体和酸性细胞器等其他亚细胞组分分离开来。各亚细胞组分产量和纯度都较高,组分间不交叉污染,回收率在65%左右。而且,免疫磁性分离技术处理温和,分离得到的各组分保持了较好的完整性。应用免疫磁性技术,监测DOX及其代谢产物在人乳腺癌细胞（MCF-7/WT和MCF-7/ADR）亚细胞组分中的分布变化,并研究了P糖蛋白抑制剂（如维拉帕米）和趋溶酶体试剂（如氯化铵）等对其在亚细胞组分中分布的影响。为进一步阐明DOX代谢途径的机制,我们构建了稳定过表达醛-酮还原酶（Aldo-keto reductase 1C3, AKR1C3）的MCF-7细胞株。应用建立的LC/MS/MS分析方法,本研究比较了MCF-7/AKR1C3细胞和MCF-7/WT细胞的DOX代谢产物的水平变化。与对照组MCF-7/WT细胞相比,实验组MCF-7/AKR1C3细胞DOX的转化水平（DOXol/DOX）明显增加,有统计学差异（P=0.0373）。这一结果表明,AKR1C3可能是催化DOX代谢反应的主要参与酶之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 实验部分
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 LC/MS/MS和HPLC条件
• 1.3.1 LC/MS/MS条件
• 1.3.2 HPLC条件
• 1.4 细胞的培养
• 1.5 样品的处理
• 1.5.1 细胞破裂物的制备
• 1.5.2 DOX,DOXol和DAU贮备液配制
• 1.5.3 标曲和质控样品的制备
• 1.5.4 提取方法的优化
• 1.5.5 细胞样品的预处理
• 1.6 方法学的验证
• 1.7 采集DOX细胞药代动力学“量—时”变化曲线
• 1.8 LC/MS/MS和传统的HPLC法的比较
• 1.9 免疫磁性法分离线粒体和酸性亚细胞
• 1.10 蛋白免疫印迹分析
• 1.11 纯化的亚细胞组分样品的前处理和LC/MS/MS测定分析
• 1.12 构建稳定过表达AKR1C3的MCF-7细胞株
• 1.12.1 慢病毒表达载体的构建与鉴定
• 1.12.2 293T细胞转染
• 1.12.3 筛选稳定过表达AKR1C3的MCF-7细胞株
• 1.13 MCF-7/WT和MCF-7/AKR1C3细胞DOX代谢水平的测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 色质联用条件的优化
• 2.2 提取方法的建立
• 2.3 方法学验证
• 2.4 亚细胞区域内的DOX和DOXol水平
• 2.5 DOX量-时变化曲线
• 2.6 方法比较
• 2.7 免疫磁性分离条件的优化
• 2.8 纯化的亚细胞组分内DOX和DOXol的测定
• 2.9 构建稳定过表达AKR1C3的MCF-7细胞株
• 2.9.1 重组质粒的PCR及测序鉴定
• 2.9.2 慢病毒的包装及滴度测定
• 2.9.3 筛选建立稳定过表达AKR1C3的MCF-7细胞株
• 2.9.4 稳定株AKR1C3表达水平检测
• 2.10 MCF-7/AKR1C3细胞DOX代谢水平的测定
• 3 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢