论文摘要
目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是发生在老年人的一种以渐进性认知能力障碍为主的神经退行性疾病。随着人类社会进入老龄化,AD的发病率呈逐年上升趋势,每年65-85岁的人中约有5%-8%成为AD患者,AD病已经成为一个很严重的医学和社会问题。由于缺乏有效的治疗手段,AD病已成为危害人类健康的主要致死性疾病之一。AD的典型病理特征包括:β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）在脑内沉积形成老年斑（senile plaques,SP）;神经元内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）;神经元的凋亡与丢失。神经元凋亡是最终导致神经元丢失的重要因素。众所周知,Aβ的脑内异常沉积是AD形成和发展的关键因素。越来越多的研究表明:Aβ异常沉积可以诱发细胞氧化应激,启动细胞内多种蛋白参与凋亡信号级联反应,造成神经元的凋亡与丢失,导致患者出现渐进性认知功能障碍。但究竟有哪些已知或未知的蛋白参与了Aβ诱导的神经元凋亡,以及这些蛋白分子之间的相互作用和调控机制,目前尚未能完全阐明。因此,进一步研究Aβ致神经元凋亡的机制和寻找到抑制Aβ诱导神经元凋亡的药物则非常重要。人参皂甙Rb1（GSRb1）是人参皂甙26个单体之一,占人参提取物的0.37-0.5%。研究表明人参皂甙Rb1能够进入血脑屏障,对中枢神经系统具有很强的药理作用,但详细的作用机制还有待阐明。本研究体内实验拟采用侧脑室立体定位注射Aβ25-35建立Aβ大鼠模型,同时给予人参皂甙Rb1进行干预,观察人参皂甙Rb1对Aβ模型大鼠空间学习记忆能力的影响,观察人参皂甙Rb1对Aβ模型大鼠海马结构SOD、GSH-PX及MDA的影响,观察人参皂甙Rb1对Aβ模型大鼠海马结构神经元Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达的影响;体外实验拟采用Aβ25-35诱导损伤PC12细胞建立神经元模型,观察人参皂甙Rb1对Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞存活率、细胞凋亡率、细胞ROS相对荧光强度、细胞的p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK蛋白表达的影响;探讨人参皂甙Rb1对神经元的保护作用及机制,为AD病的防治提供科学依据。材料与方法1、体内实验（1）实验动物及分组:鼠龄12周的SD雄性大鼠60只,随机分为GSRb1小剂量治疗组（5mg/kg/d）、GSRb1中剂量治疗组（10mg/kg/d）、GSRb1大剂量治疗组（20mg/kg/d）、模型组、假手术对照组和正常对照组,每组10只。采用大鼠侧脑室立体定位注射老化的Aβ25-3510μg建立Aβ大鼠模型。造模后第3天各治疗组腹腔注射不同剂量GSRb1,连续四周后检测各项指标。（2）采用Morris水迷宫测试大鼠逃避潜伏期和通过原平台次数以检测大鼠空间学习记忆能力的变化。（3）采用生物化学方法检测各组大鼠海马结构SOD和GSH-PX活性、MDA的含量。（4）采用Western blotting方法检测各组大鼠海马结构Bcl-2、Bax的蛋白表达。（5）采用免疫组织化学方法观察各组大鼠海马结构Caspase-3阳性细胞的分布和表达。2、体外实验（1）细胞培养及分组:选用PC12细胞株,培养基为RPMI-1640,内含10%胎牛血清,5%马血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml,置37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。细胞分为GSRb1小剂量治疗组（PC12+Aβ+0.01mM GSRb1）、GSRb1中剂量治疗组（PC12+Aβ+0.1mMGSRb1）、GSRb1大剂量治疗组（PC12+Aβ+1mM GSRb1）、模型组（PC12+Aβ）、对照组（PC12细胞）。给药24h后进行下列检测。（2）采用MTT比色法检测各组细胞的存活率。（3）采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡百分率。（4）采用荧光分光光度计检测各组细胞ROS相对荧光强度。（5）采用Western blotting方法检测各组细胞的p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK蛋白表达。3、统计学分析应用SPSS16.0统计软件,单因素方差分析进行组间比较,数据采用均数±标准差（（?）±s）表示。P＜0.05为有统计学意义,P＜0.01为有显著统计学意义。结果1、体内实验结果（1） Morris水迷宫实验结果显示:模型组大鼠在定位航行试验中平均逃避潜伏期较对照组显著延长,空间探索试验中跨越原平台位置次数明显减少（P＜0.01）。GSRb1各剂量组平均逃避潜伏期较模型组明显缩短（P＜0.05）,跨越原平台位置次数明显增加（P＜0.05）,与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。（2）生化检测结果显示:模型组大鼠海马结构SOD活性（58.73±2.67U/mg）较正常对照组（85.64±3.12U/mg）和假手术对照组（86.39±2.35U/mg）明显降低（P＜0.05）,而这种降低可被GSRb中、大剂量组（73.64±3.21U/mg、78.42±2.89U/mg）所抑制（P＜0.05）。模组大鼠海马结构MDA含量（6.81±0.45nmol/mg）较正常对照组（4.53±0.35nmol/mg）和假手术对照组（4.43±0.36nmol/mg）明显升高（P＜0.05）,而这种升高可被GSRb1中、大剂量组（5.53±0.67nmol/mg、4.93±0.12nmol/mg）所抑制（P＜0.05）。模型组大鼠海马结构GSH-PX活性（4.81±0.45U/mg）较正常对照组（7.53±0.66U/mg）和假手术对照组（7.43±0.36U/mg）明显降低（P＜0.05）,而这种降低可被GSRb1中、大剂量组（6.73±0.71U/mg、6.93±0.79U/mg）所抑制（P＜0.05）。（3） Western blotting结果显示:模型组大鼠海马结构Bcl-2蛋白表达相对值较对照组显著降低（P＜0.01）,而GSRb1小、中、大各剂量组可上调Bcl-2的表达（P＜0.05）;模型组大鼠海马结构Bax蛋白表达相对值较对照组显著增高（P＜0.01）,而GSRb1小、中、大各剂量组可下调Bax的表达（P＜0.05）。（4）免疫组织化学结果显示:Caspase-3阳性反应产物均呈棕黄色或棕褐色细颗粒状,主要沉积在海马CA1区和CA3锥体细胞层及齿状回的颗粒细胞层。对照组大鼠海马结构可见少量的Caspase-3阳性神经元;模型组阳性反应产物着色较对照组加深,平均光密度值较对照组显著增高（P＜0.01）;而GSRb1中、大剂量组Caspase-3阳性反应产物的平均光密度值较模型组明显减少（P＜0.05）。2、体外实验结果（1） MTT结果显示:给药24h后Aβ模型组细胞生存率（48.55±1.39%）明显低于PC12对照组（99.23±1.35%）（P＜0.05）,而这种降低可被GSRb1小、中、大剂量（64.45±1.67%、72.34±1.34%、81.67±1.09%）所抑制（P＜0.05）,且呈剂量依赖性。（2）流式细胞仪结果显示:给药24h后Aβ模型组细胞凋亡百分率（54.09±2.85）%明显高于PC12对照组（0.29±0.01%）（P＜0.05）,而这种升高可被GSRb1小、中、大剂量（46.17±2.94%、32.34±2.68%、20.50±1.23%）所抑制（P＜0.05）,且呈剂量依赖性。（3） ROS相对荧光强度检测结果显示:给药24h后Aβ模型组细胞内ROS的相对荧光强度（370±24.58）明显高于PC12细胞对照组（80±5.49）（P＜0.05）,而这种升高可被GSRb1小、中、大剂量（330±21.78、310.34±32.81、150.50±17.45）所抑制（P＜0.05）,且呈剂量依赖性。（4） Western blotting结果显示:给药24h后Aβ模型组细胞内p-ERK、p-P38蛋白表达明显高于PC12细胞对照组（P＜0.05）,而这种升高可被GSRb1小、中、大剂量所抑制（P＜0.05）。结论1、人参皂甙Rb1可通过提高Aβ模型大鼠海马结构SOD和GSH-PX酶活性、降低MDA含量,增强海马结构神经元的抗氧化能力,从而提高动物的认知能力。2、人参皂甙Rb1可通过上调海马结构抗凋亡蛋白Bcl-2、下调促凋亡蛋白Bax的表达、改变Bax/Bcl-2的平衡比值,降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达等环节,对抗Aβ25-35诱导的神经元凋亡,发挥对神经元的保护作用。3、人参皂甙Rb1可通过降低PC12细胞内ROS含量,抑制磷酸化p-ERK和p-P38蛋白表达,对抗Aβ25-35诱导PC12细胞的凋亡,发挥对神经元的保护作用。
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