论文摘要
目的：研究酒精灌胃对小鼠生长发育、睾丸及生精功能的影响,了解制备小鼠睾丸石蜡切片、HE染色等技术。掌握原位缺口末端标记法（TUNEL）检测生精细胞凋亡和免疫组织化学染色技术对标本的检测,来探讨各实验组Caspase-3蛋白和Survivin蛋白的表达情况以及与酒精所引起的生精细胞凋亡的相关性。方法：本实验分别以蒸馏水、红葡萄酒、低剂量和高剂量白酒给予小鼠按0.01ml/g灌胃。实验期间每周测量小鼠体重并观察各组小鼠生长发育和酒精所引起的状态变化。经3生精周期,成功建立小鼠酒精毒性模型。断头处死小鼠并立即测量双侧睾丸重量等。制备小鼠睾丸的石蜡切片,利用HE染色观察各组小鼠睾丸曲细精管和生精细胞形态学变化,并利用原位缺口末端标记法检测各组生精细胞的凋亡指数（AI）变化。然后应用免疫组化SP法检测Caspase-3蛋白和Survivin蛋白在各实验组的表达情况,采用免疫反应评分（immunoreactivity score, IRS）进行半定量分析,即IRS：0分：阴性（-）,1～4分：弱阳性（+）,5～8分：中度阳性（++）,9-12分：强阳性（+++）。采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计处理,即计量资料进行方差分析、等级资料进行非参数Kruskal-Wallis检验,两变量之间的关系采用：Spearman等级相关分析法等,对各实验组小鼠体重、睾丸等重量及生精细胞凋亡指数、Caspase-3蛋白和Survivin蛋白表达情况统计分析。结果：本实验以0.01mL/g酒精灌胃约3个生精周期后,成功建立小鼠酒精毒性模型。实验期间对照组和葡萄酒组小鼠食欲正常,精神状态好,白酒灌胃组小鼠出现醉酒现象。红葡萄酒灌胃组小鼠平均体重增加最多,而高剂量白酒灌胃组增加最少,从各组小鼠平均体重增加变化来看,其中高剂量白酒灌胃小鼠体重增加明显小于低剂量组的小鼠(（P=0.003）,随着白酒剂量的增加,小鼠体重增加越不明显。同时检测各组小鼠睾丸的相对重量（双侧睾丸相对于实验前小鼠自身体重）和HE染色下曲细精管的直径的变化,也呈现基本一致性的结果。利用TUNEL检测各组小鼠生精细胞凋亡指数,蒸馏水灌胃组生精细胞平均凋亡指数为0.1394±0.0104,高于红葡萄酒组（0.1016±0.0124,P=-0.000）,而低于白酒灌胃组（0.2213±0.0149、0.2582±0.0177,分别为P=0.000,P=0.000）,其中红葡萄酒组生精细胞平均凋亡指数最低,高剂量白酒组最高,且随之白酒剂量的增加生精细胞平均凋亡指数也逐渐增多。免疫组化结果显示白酒灌胃组小鼠睾丸Caspase-3蛋白的表达较对照组和红葡萄酒组较高,且随着酒精剂量的增加其表达越强；Survivn蛋白的表达恰恰相反。而葡萄酒组小鼠睾丸Caspase-3蛋白的表达低于其他各组,甚至低于正常对照组,Survivin蛋白的阳性表达则最显著。随着各组小鼠生精细胞凋亡程度的增加,Caspase-3蛋白的表达越强,呈正相关关系（r=0.717,P<0.01）；而Survivn蛋白表达越弱,呈负相关关系（r=-0.631,P<0.01）。结论：适量红葡萄酒灌胃对哺乳动物生长发育、睾丸、生精功能等具有促进作用,白酒灌胃则具有抑制作用,且随着白酒剂量的增加,抑制作用越明显。Caspase-3和Survivn蛋白的表达与酒精所引起的生精细胞凋亡的变化密切相关。但是其作用机制可能与酒中某些成分有关,但是尚不能确定,需要实验进一步证实。本实验或许可以改变人们对饮酒的认识,以及为临床治疗男性不育症提供新的思路。