七氟烷预处理对兔脊髓缺血/再灌注损伤保护作用的研究

论文摘要

【背景】尽管临床上已采用多种方法减轻脊髓缺血损伤,但是胸腹主动脉瘤手术患者不可避免发生脊髓缺血,有数据显示3%～18%患者发生永久性损伤（急性截瘫和/或延迟性截瘫）。除此之外,脊髓肿瘤压迫,脊柱畸形,椎管狭窄等患者围手术期也会出现脊髓缺血/再灌注损伤。截瘫造成患者失去工作能力并担负巨额的医疗费用,给患者本人及家庭造成深痛的打击和巨大的经济负担,同时加重整个社会的医疗保险的负担。七氟烷具有刺激性低,诱导、苏醒迅速,麻醉维持平稳,肝、肾毒性低,心律失常发生率低等优点,被广泛应用于临床麻醉。已有研究报道,七氟烷预处理可诱导缺血耐受,对缺血、缺氧的心、脑起保护作用,但其对脊髓缺血/再灌注损伤是否具有保护作用尚不清楚。本研究采用兔肾下腹主动脉阻闭20min缺血/再灌注模型,研究单次七氟烷预处理是否可诱导快速缺血耐受,减轻脊髓缺血/再灌注损伤,并探讨其可能的作用机制。【方法】雄性新西兰大白兔,2.0千克～2.9千克。实验一:随机分为2组,每组各6只动物。I/R组动物行20min脊髓缺血后再灌注48h。Sham组动物接受同样的麻醉和手术准备,但不行缺血/再灌注损伤。于再灌注后4h,8h,12h,24h及48h行后肢运动功能评分,再灌注后48h取L5节段脊髓行HE染色、p-ERK1/2染色、Fluoro-Jade B染色和TUNEL染色。计数脊髓前角正常神经元、Fluoro-Jade B阳性神经元和TUNEL阳性神经元。实验二:随机分为4组,每组10只动物。Sev+W1h组和Sev+W15min组动物面罩密闭吸入3.7%（1.0MAC）七氟烷+96%氧气预处理30min,分别洗脱1h或15min;O2+W1h组和O2+W15min组动物面罩密闭吸入96%氧气30min,分别洗脱1h或15min;4组动物均行20min脊髓缺血后再灌注48h。于再灌注后4h,8h,12h,24h及48h行后肢运动功能评分,再灌注后48h取L5节段脊髓行HE染色和脊髓前角正常神经元计数。实验三:随机分为2大组,Sev组和O2组。Sev组动物面罩密闭吸入3.7%（1.0MAC）七氟烷+96%氧气预处理30min;O2组动物面罩密闭吸入96%氧气30min,两组动物均洗脱1h后行脊髓缺血20min后再灌注。每组分别按最后观察点为再灌注后8h,1d,2d,3d,5d,7d分为六组,每组6只动物。于再灌注后8h,1d,2d,3d,5d,7d行后肢运动功能评分,取L5节段脊髓行HE染色、Fluoro-Jade B染色和TUNEL染色。计数脊髓前角正常神经元、Fluoro-Jade B阳性神经元和TUNEL阳性神经元。实验四:随机分为4组,每组8只动物。Vehicle+Sev组和Vehicle+O2组动物静脉注射溶剂DMSO 50μL/kg,20min后分别吸入七氟烷和氧气预处理;U0126+Sev组和U0126+O2组动物静脉注射50μL/kg 0.4% U0126（溶于DMSO）,20min后分别吸入七氟烷和氧气预处理;预处理方法和兔脊髓缺血/再灌注方法同实验三。于再灌注后4h,8h,12h,24h及48h行后肢运动功能评分,再灌注后48h取L5节段脊髓行HE染色、Fluoro-Jade B染色和TUNEL染色。计数脊髓前角正常神经元、Fluoro-Jade B阳性神经元和TUNEL阳性神经元。【结果】实验一:再灌注48h时,与Sham组相比,I/R组动物后肢运动功能评分降低,脊髓前角正常神经元数量显著减少,脊髓前角Fluoro-Jade B阳性神经元数量和TUNEL阳性神经元数量显著增多（P < 0.01）;脊髓组织白质p-ERK1/2大量表达,并与星形胶质细胞标记物GFAP复染,但脊髓前角神经元没有表达p-ERK1/2。实验二:再灌注48h时,与O2+W1h组相比,Sev+W1h组动物后肢运动功能评分增高,脊髓前角正常神经元数量显著增多（P<0.01）,而Sev+W15min组和O2+W15min组比较差异无显著意义（P > 0.05）。实验三:再灌注后1d起,Sev组动物后肢运动功能评分显著高于O2组（P < 0.05）,再灌注后2d～7d,每组动物后肢运动功能评分随时间变化无显著差异（P > 0.05）; 2组动物脊髓前角神经元计数均从再灌注后8h开始减少,48h时计数减到最少,随后没有显著变化（P > 0.05）,各时间点Sev组动物脊髓前角正常神经元数量显著多于O2组（P < 0.05）; Sev组动物的脊髓前角变性神经元计数从再灌注后8h开始从0增加,3d时计数增至最多,随后逐渐减少;O2组动物脊髓前角变性神经元计数8h时已增加,至3d时增至最多,随后逐渐减少,7d时2组动物脊髓前角Fluoro-Jade B阳性神经元计数均为0,其余各时间点Sev组动物脊髓前角Fluoro-Jade B阳性神经元数量显著少于O2组（P < 0.05）; 2组动物脊髓前角凋亡神经元计数均从再灌注后8h以后开始从0增加,2d时计数增至最多,随后逐渐减少;7d时均减至0点,再灌注后1d～5d时Sev组动物脊髓前角TUNEL阳性神经元数量显著少于O2组（P < 0.05）。实验四:再灌注48h时,与Vehicle+O2组和U0126+Sev组相比,Vehicle+Sev组动物后肢运动功能评分增高,脊髓前角正常神经元数量显著增多,脊髓前角Fluoro-Jade B阳性神经元数量和TUNEL阳性神经元数量显著减少（P≤0.01）,而U0126+Sev组与U0126+O2组比较实验结果差异无统计学意义（P > 0.05）。【结论】1.脊髓缺血20min再灌注后5d内脊髓前角运动神经元发生变性和凋亡,证实神经元变性和凋亡是缺血/再灌注后脊髓前角运动神经元损伤、死亡的重要形式。2.脊髓缺血20min再灌注48h时星形胶质细胞p-ERK1/2表达阳性,脊髓神经元无p-ERK1/2表达。证实ERK1/2的激活在脊髓缺血/再灌注中扮演重要角色。3.缺血前1h给予30min 3.7%（1.0MAC）七氟烷预处理可以诱导快速缺血耐受,减轻兔脊髓缺血20min再灌注神经损伤。4.缺血前1h给予30min 3.7%（1.0MAC）七氟烷预处理诱导快速缺血耐受的保护效果可以持续至再灌注后7d,此时神经元变性和凋亡均已结束,证实七氟烷预处理是通过减轻神经损伤而不是延迟神经损伤对脊髓缺血/再灌注起保护作用。5. ERK1/2抑制剂U0126可以抑制七氟烷预处理对脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用,同时也抑制了七氟烷预处理减轻脊髓组织缺血/再灌注后前角运动神经元变性和凋亡的作用。一定程度上说明七氟烷预处理通过激活ERK1/2磷酸化,抑制其下游神经元变性和凋亡对脊髓缺血/再灌注损伤起保护作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 兔脊髓缺血/再灌注损伤与神经元变性、凋亡及P-ERK1/2 表达的关系
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二七氟烷预处理减轻兔脊髓缺血/再灌注损伤
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 七氟烷预处理对兔脊髓缺血/再灌注损伤保护作用的长时程观察
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 七氟烷预处理对兔脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用与ERK1/2 的关系
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢