C-Flip蛋白在TRAIL诱导的结肠癌细胞凋亡中的作用及机制初探

C-Flip蛋白在TRAIL诱导的结肠癌细胞凋亡中的作用及机制初探

论文摘要

目的:(1)观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对结肠癌细胞株SW480,HT29,HCT116的不同敏感性及三株结肠癌细胞c-Flip蛋白的基础表达水平。(2)探讨PI3K/Akt信号通路在TRAIL诱导结肠癌细胞c-Flip表达过程中的作用,揭示结肠癌细胞对TRAIL敏感性发生改变的部分机制。方法:以结肠癌细胞株SW480,HT29,HCT116为研究对象。(1)用MTT法和流式细胞术检测不同时间(0,6,12,24,48h)和不同浓度(0,25,50,100ng/ml)的TRAIL对这3株细胞的凋亡率的影响(其中流式细胞术检测100ng/ml TRAIL作用48小时的细胞凋亡率)。(2)Western blot检测三株细胞中c-Flip蛋白的表达水平。(3)根据细胞株对TRAIL的不同敏感性以及c-Flip蛋白的表达水平,选取相对不敏感细胞株HT29进行下一步实验,将其分为空白组;加入TRAIL(100ng/ml)组;以及用特异性抑制剂ly294002预处理后加入TRAIL(100ng/ml)组。用流式细胞术分别检测3组细胞凋亡率的变化,并用Western blot检测c-Flip蛋白表达的变化情况。(4)用100ng/ml TRAIL分别刺激HT29细胞不同时间(0,15,30,60,120min)后,Western blot检测磷酸化Akt表达水平的变化。结果:(1)SW480和HCT116对TRAIL相对敏感,且呈时间剂量依赖性,而HT29相对不敏感。(2)C-Flip蛋白在三株细胞中的表达水平不同,且可能与它们对TRAIL的不同敏感性有关。(3)将HT29细胞分为3组(分别为空白组,100ng/ml TRAIL组,ly294002+100ng/mlTRAIL组)进行处理,结果显示ly294002预处理组的c-Flip蛋白表达水平明显降低,流式细胞术检测发现ly294002预处理组的凋亡率明显增加。(4)HT29细胞的p-Akt的基础表达水平较高,100ng/ml TRAIL作用HT29细胞15,30,60,120min后,p-Akt蛋白的表达明显降低,但各组间的p-Akt表达无明显差异。结论:(1)不同结肠癌细胞株对TRAIL有不同的敏感性:SW480和HCT116对TRAIL相对敏感,而HT29相对不敏感。(2)通过PI3K/Akt通路可下调c-Flip的表达,并使结肠癌细胞HT29对TRAIL的敏感性发生逆转。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 前言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.2 主要实验方法
  • 2.2.1 细胞培养
  • 2.2.2 TRAIL处理细胞的方法
  • 2.2.3 LY294002阻断通路的方法
  • 2.2.4 细胞总蛋白的提取
  • 2.2.5 Western blot
  • 2.2.6 MTT法检测TRAII预处理对HT29 HCT116 SW480细胞药物敏感性的影响
  • 2.2.7 流式细胞术分析
  • 2.2.8 统计学分析
  • 第三章 结果
  • 3.1 MTT法检测TRAIL对HCT116,SW480,HT29细胞的抑制率
  • 3.2 流式细胞术检测TRAIL对HCT116,SW480,HT29细胞的凋亡率
  • 3.3 C-Flip蛋白的基础表达
  • 3.4 阻断PI3K/Akt途径后C-Flip蛋白表达和凋亡率的变化
  • 3.5 TRAIL对磷酸化Akt表达水平的影响
  • 第四章 讨论
  • 4.1 不同的结肠癌细胞株对TRAIL的不同敏感性
  • 4.2 结肠癌细胞株c-Flip的表达水平可能与它们对TRAIL的不同敏感性有关
  • 4.3 对PI3K/Akt通路的抑制可增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性
  • 4.4 TRAIL可降低结肠癌细胞株中P-Akt的表达
  • 4.5 TRAIL可通过PI3K/Akt通路下调c-Flip的表达,使结肠癌细胞HT29的对其的敏感性发生逆转
  • 第五章 结论
  • 第六章 参考文献
  • 第七章 综述
  • 致谢
  • 攻读学位期间的研究成果
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