移植胰岛血管化的观察

论文摘要

背景：1型糖尿病（type1diabetesmellitus，T1DM）是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，它同患者胰岛素分泌不足有关。由于胰岛移植能够实现胰岛素非依赖以及避免糖尿病并发症发生，提高糖尿病人的长期生活质量，因此胰岛移植被人们认为是治疗T1DM的理想方法。迄今为止，临床报道胰岛移植后，病人不依赖于外源性胰岛素最长时间为14年，且移植物仍在发挥功能。但人们发现在胰岛移植后，移植物的功能和数量都会有所下降，多数病人长期移植效果不太理想。80%的移植病人移植后5年有C肽分泌，但仅有10%左右移植胰岛病人不依赖外源性胰岛素。这证明胰岛移植物存活但是功能不足。胰岛移植后7天移植胰岛开始形成新的微小血管，移植后7天内无血液供应导致大量胰岛凋亡、死亡，仅30%胰岛存活；血管生成不足、密度低、血流量低，氧分压低，移植胰岛体积比正常胰岛缩小，影响移植胰岛的自我复制能力可能是其主要因素。目前多数学者认为胰岛移植后血管化不足是影响胰岛移植长期效果的最重要因素。而免疫排斥并非导致移植胰岛长期效果不好的主要因素，因为实验证据表明即使移植自身胰岛，病人在短期可以维持正常血糖水平，但是长期的效果仍然令人失望。而对自身胰岛移植物的研究也支持胰岛移植后1血管化不足与胰岛移植长期效果差的关系密切。要使胰岛移植在临床上广泛应用并且获得长期稳定疗效，研究促进移植后胰岛血管化的方法及其机理是克服胰岛移植血管化不足的有效策略。可能为治疗T1DM提供更为理想的治疗手段。肿瘤移植模型是常用的研究肿瘤动物模型。肿瘤细胞种植于局部后，也会形成新的血管网来支持肿瘤的进一步生长。越来越多的研究表明，肿瘤的间质细胞在肿瘤血管生成中起了非常重要的作用，间质中的成纤维细胞受到肿瘤分泌的多种促血管生成因子的刺激，就会被激活，上调血管生成的关键分子,血管内皮细胞生长因子-A（vascularendothelialgrowthfactor-A,VEGF-A），并且分泌诸如结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor,CTGF）、转化生长因子β1（transforminggrowthfactor-β1,TGFβ1）这些强有力的促血管生成因子[8-10]，从而使种植肿瘤的新生血管加速，血管密度增加。基于上述理由，本课题组着重研究在激活或未激活的成纤维细胞（fibroblast,FB）联合胰岛移植的干预下，胰岛内部微血管密度的变化，初步探讨成纤维细胞促进胰岛内微血管发生的机制。目的：探讨胰岛联合激活/未激活FB移植后，各实验组胰岛内部微血管密度变化；探讨胰岛联合激活/未激活FB移植后，胰岛内微血管密度增加是由供体还是受体FB起主要作用。方法：本研究是一个新的实验模型并可应用于临床胰岛移植。肿瘤细胞上清液激活FB及检测（略，肖衡提供）。雄性C57BL/6小鼠（6-7周龄）。分组：A组:单纯胰岛（H2d）移植；B组：胰岛（H2d）联合供体FB（H2d）移植；C组：胰岛（H2d）联合受体FB（H2b）移植；D组：胰岛（H2d）联合激活的供体FB（H2d）移植；E组：胰岛（H2d）联合激活的受体FB（H2b）移植;F组：同基因胰岛（H2b）移植。T1DM模型通过腹腔注射链脲菌素（streptozocin,STZ）诱导；胰岛联合激活/未激活FB胞行肾被膜下移植；相同条件下使用CollagenaseP溶液胰管灌注，聚蔗糖-400（Ficoll-400）不连续密度梯度纯化法获取小鼠胰岛，双硫腙（dithizon,DTZ）检测胰岛形态和纯度，0.4%锥虫蓝检测胰岛存活率，使用小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒检测胰岛分泌功能。快速血糖试纸条检测移植后小鼠血糖变化，保证移植供体胰岛高质量；免疫荧光共聚焦检测不同时间段（5d、14d和30d）胰岛内微血管密度；适时取下组织HE染色观察不同组别移植胰岛组织学变化（各组移植物去功能化时取标本，A、B、C、D、E、F组取标本时间分别为14d、14d、14d、30d、100d、100d）；异基因移植小鼠（A组、B组、C组、D组、E组）接受他克莫司和西罗莫司抗排斥治疗。结果：肿瘤细胞上清液对FB的生长有一定的促进作用；肿瘤细胞上清液组成的条件培养基能促进成纤维细胞α-SMA与VEGF-A的表达（略）；成功分离、纯化小鼠胰岛；每只受体小鼠接受900±30个胰岛当量（isletequivalent，IEQ），每只BALB/c供体小鼠平均收获（350±25）个IEQ，纯度85%±5%，每只C57BL/6供体小鼠平均收获（324±18）个IEQ，纯度为81%±4%；胰岛存活率均为：97%±2%；胰岛分泌功能良好（SI>2），胰岛移植后均能逆转高血糖至正常；移植前各组小鼠血糖值比较无统计学意义（P>0.05），移植术后3天血糖均<11.0mmol/L，组间比较无统计学意义（P>0.05），A、B、C组小鼠血糖降低值组间比较均无统计学意义（P>0.05），E、F组小鼠血糖降低值比较无统计学意义（P>0.05），E组血糖降低值平均较F组低，D组与A、B、C组和E组、F组小鼠血糖降低值组间比较均有统计学意义（P<0.05）。A、B、C、D、E、F组小鼠平均存活时间为13±1d、15±2d、15±2d、29±2d、>100d、>100d；移植后5天各移植组胰岛血管密度两两比较均无统计学意（P>0.05），移植后30天移植胰岛内微血管密度两两比较均有统计学意义（P<0.05）；HE染色：A、B、C组移植胰岛炎症细胞浸润严重，部分胰岛形态被破坏；D、E组胰岛少量炎症细胞浸润，形态规则，呈圆形或椭圆形，胞质与胞核区分明显，多核；F组胰岛形态规则，胞质淡染，多核，存活状态良好。结论：在现实验和临床阶段，本研究为移植胰岛再血管化提供了一种新思路；相对于单纯胰岛移植和胰岛联合未激活FB移植，激活后FB在促进胰岛再血管化方面作用显著，尤其是供体来源，是否与供体激活FB被受体免疫系统排斥有关还不清楚；受体来源的激活FB联合胰岛移植能治愈糖尿病，并且能达到长期存活。胰岛联合激活后的受体FB移植，是否可以减少胰岛移植数量，最低移植多少胰岛数量还需进一步研究。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述:胰岛移植再血管化的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章