论文摘要
凋亡（Apoptosis）,又称程序化细胞死亡,是机体维持自稳状态最重要的机制之一。健康成年人每天平均有500亿至700亿个衰老、恶变、或损伤的细胞发生凋亡,绝大部分凋亡细胞在启动凋亡程序后裂解为凋亡小体（apoptotic body）,凋亡小体被局部吞噬细胞识别并以一种非炎性的方式清除,同时新生细胞得以再生并籍此维持组织稳态。理论上说凋亡是一种近乎完美的机制,但近年来,已有研究证实体细胞非正常凋亡与自身免疫性疾病有着千丝万缕的关系,凋亡小体中包含的细胞内成分如果没有经过有效的加工可能无法被吞噬细胞识别处理从而形成新的自身抗原,这种特殊的自身抗原被称为凋亡新生抗原,其英文名apotope则源自凋亡（apoptosis）和抗原表位（epitope）。凋亡新生抗原的产生多由于靶细胞存在特异性分化缺陷,凋亡后无法加工分解某一类自体蛋白,导致该类蛋白经由凋亡小体长期在局部吞噬细胞和抗原递呈细胞中积累,并最终打破免疫耐受成为自身抗原,导致器官特异性自身免疫损伤。原发性胆汁性肝硬化（primary billary cirrhosis,PBC）是一种典型的器官特异性自身免疫性疾病,主要累及中年女性,在欧美40岁以上女性中发病率达到千分之一,在我国发病率也呈逐年上升的趋势。PBC的主要病理学特征为免疫细胞特异性识别并杀伤肝内胆管上皮细胞（human intrahepatic biliary epithelial cells,HiBEC）,导致肝内小胆管渐进性消失,肝内胆汁淤积致肝组织反复再生并发生纤维化,最终导致肝硬化和肝功能衰竭,PBC整个病程长达20年以上,除部分晚期患者进行肝脏移植外,目前尚缺少有效治疗手段。免疫学方面,PBC患者血清中存在高滴度自身抗体,目前已鉴定的自身抗原主要包括位于线粒体内膜的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（PDC-E2）, 2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2亚基（OGDC-E2）和支链2-氧酸脱氢酶复合体（BCOADC-E2）,除自身抗体外,PBC患者体内也发现PDC-E2抗原特异性T细胞。目前在PBC研究领域最重要的一个问题是:PDC-E2等自身抗体广泛存在于各类有核细胞,为什么PBC患者的免疫系统却特异性攻击HiBEC细胞?换言之,免疫学研究需要解释发生在PBC中的器官特异性问题。为解决这一问题,结合凋亡新生抗原理论,本研究提出以下假说并利用实验验证:人HiBEC细胞存在缺陷,导致某些线粒体内膜蛋白在凋亡后无法降解,这些无法降解的蛋白通过凋亡小体被肝内吞噬细胞和抗原递呈细胞捕获并递呈,导致自身抗原外漏并可能最终引起免疫耐受的缺失引发疾病。在此基础上,我们还想证明这些包含有PBC特异抗原的凋亡小体是否具有免疫原性,在PBC状态下,我们认为凋亡的胆管上皮细胞释放的凋亡小体主要可能影响2种细胞即专业吞噬细胞如巨噬细胞,树突状细胞和非专业吞噬细胞如胆管上皮细胞本身,已有报道证实PBC患者的巨噬细胞在胆管上皮细胞和凋亡小体和抗线粒体抗体同时刺激的情况下会大量释放促炎性细胞因子,而胆管上皮细胞本身是否介入凋亡细胞的清除,如果介入,这些包含自身抗原的凋亡小体对胆管上皮细胞又有何影响?上述问题的解决将会更合理的解释PBC中胆管上皮特异性损伤,并有助于揭示PBC更细致的免疫致病机制,为可能免疫学治疗提供介入位点。第一部分肝内胆管上皮细胞的原代培养及凋亡的诱导在此部分中研究中,我们主要建立了人HiBEC细胞,人乳腺上皮细胞,人支气管上皮细胞和人表皮细胞的原代培养体系。人HiBEC细胞经细胞角蛋白18,19免疫荧光染色鉴定阳性率达90%以上。在此基础上我们分别利用亲水性胆盐甘氨鹅脱氧胆酸钠（sodium glycochenodeoxycholate,GCDC）,紫外辐射,以及抗Fas抗体诱导上述四种原代培养细胞凋亡。结果表明GCDC可有效诱导四种原代培养细胞系发生凋亡,经浓度梯度实验证实GCDC在1mM时给药4小时可以诱导达高达90%的人HiBEC细胞发生凋亡,同样的条件也可以有效诱导约其他3种原代细胞发生凋亡（凋亡率40%-50%）;而紫外辐射（强度1650 J/m2至2200J/m2）仅能诱导约25%原代细胞发生凋亡;尽管四种原代细胞表面均有较高强度的Fas表达,但给予Fas抗体却几乎无法诱导凋亡。亲水性胆盐为人胆汁内主要毒性成分,利用GCDC诱导胆管上皮细胞凋亡较好的模拟了PBC中胆管上皮细胞的病理性凋亡。我们随后利用超速离心收集了培养上清中的凋亡小体用于下一阶段凋亡新生抗原的研究。第二部分肝内胆管上皮细胞凋亡新生抗原的鉴定在此部分的研究中,我们分离了4种细胞经GCDC诱导凋亡后的凋亡小体,并利用免疫印迹和激光共聚焦显微镜研究了3种PBC特异性自身抗原（PDC-E2,OGDC-E2,BCOADC-E2）,4种线粒体内膜蛋白（DECR1,UQCRC2,COX IV,ATPB）,和3种PBC相关的核蛋白抗原（SSA,SSB,SP100）在4种凋亡小体中分布情况。我们发现两种PBC特异抗原PDC-E2,ODDC-E2以全长抗原的形式特异性的存在于HiBEC细胞来源的凋亡小体,另一种PBC特异性抗原BCOADC-E2除了存在于HiBEC来源的凋亡小体,同时也在另外两种上皮细胞（MaEPC,BrEPC）来源的凋亡小体中被检测到。此外,在4种其他线粒体内膜蛋白中,DECR1也特异性的存在于HiBEC细胞来源的凋亡小体,我们没有发现核蛋白抗体特异性的存在与HiBEC来源的凋亡小体中。至此,我们检测到所有3种PBC特异性抗原都在胆管上皮细胞凋亡小体中以全长蛋白形式特异性的存在。我们的研究结果揭示了人类上皮细胞广泛的存在凋亡后蛋白清除缺陷,由于细胞凋亡的持续存在,这些未经处理的蛋白在进入局部吞噬细胞或抗原递呈细胞后很可能被识别为外源性蛋白而诱发免疫应答和免疫损伤。更重要的是在HiBEC细胞,这一缺陷却恰好导致PDC-E2,OGDC-E2和BCOADC-E2的凋亡后清除障碍,而这三种蛋白是已知的最重要三种PBC自身抗原,我们的发现为PBC中致病机制中包括自身抗原来源,以及胆管特异性损伤等一系列问题提供了较好的一个相对较合理的解释。第三部分PBC患者血清中抗肝内胆管上皮细胞凋亡新生抗原抗体的鉴定在此部分研究中,我们基于对上述HiBEC凋亡新生抗原的鉴定结果继续研究这些新生抗原是否在PBC患者中引发了免疫耐受的缺失,我们从PBC血清库中选取了114例PBC患者的血清,其中95例为抗线粒体抗体阳性,19例为抗线粒体抗体阴性,并随机选取性别年龄相当的76例对照血清,其中包括23例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus , SLE ） , 22例原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis,PSC）以及31例健康对照。利用免疫印迹检测了患者血清中凋亡新生抗原自身抗体的分布情况。结果显示在95例抗线粒体抗体阳性的患者中全部（100%）检测到了PDC-E2抗体,19例（20%）检测到了OGDC-E2抗体,25例（26%）检测到了BCOADC-E2抗体,值得一提的是我们新鉴定的胆管上皮细胞特异性凋亡新生抗原DECR1也在3例患者中检测到了抗体,提示PBC患者中存在针对DECR1的自身免疫也进一步验证了我们提出的凋亡新生抗原是潜在的自身抗原来源的假说。此外,抗线粒体抗原阴性患者血清中未能检测到任何针对凋亡新生抗原的抗体。第四部分肝内胆管上皮细胞对自身来源的凋亡小体免疫学反应本研究小组已经报道胆管上皮细胞来源的凋亡小体具有免疫原性,可以在AMA存在的条件下刺激PBC患者的巨噬细胞产生大量炎性细胞因子。此外,已有报道证实PBC患者肝内胆管上皮细胞表面有PDC-E2。为此在此部分研究中我们欲证实凋亡小体是否是患者肝内胆管上皮细胞表面PDC-E2的来源.我们首先证实了胆管上皮细胞表面表达包括CD51,CD61,CD93,磷酯酰丝氨酸受体（PSR）等多种吞噬相关受体以及包括TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR9在内的toll样受体。将荧光染色后HiBEC诱导凋亡,收集凋亡小体后与正常HiBEC共培养,经流式细胞术证实的共培养HiBEC内细胞可检测到荧光信号,提示HiBEC直接参与凋亡小体的清除。经激光共聚焦显微镜观察发现共培养HiBEC内部存在大量荧光染色的凋亡小体。随后我们收集了共培养HiBEC细胞上清和细胞,检测上清中多种促炎性细胞因子及趋化因子水平,发现经凋亡小体共培养后HiBEC并不分泌炎性细胞因子,但趋化因子CXCL-8和CCL-2水平较未刺激组升高约3倍,我们随后将HiBEC细胞裂解后提取RNA,利用人趋化因子PCR芯片分析HiBEC吞噬凋亡小体后趋化因子的表达谱,结果显示HiBEC吞噬凋亡小体后明显上调包括CCL8、CCL7、CCL16、CCL13在内的CCL家族趋化因子的表达。提示HiBEC通过分泌CCL家族趋化因子吸引更多的专业免疫细胞参与凋亡的清除。
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