新型β-葡萄糖苷酶菌株syzx4筛选、发酵及酶纯化表征和应用

论文摘要

本研究从腐败的玉米秸秆上分离得到一株能够发酵生产耐热耐酸性的β-葡萄糖苷酶的菌株,经过形态学和分子生物学方法的鉴定为Tolypocladium cylindrosporum syzx4。然后利用计算机辅助的方法对此菌株的发酵培养基进行了优化,菌株的筛选过程和酶的发酵过程申请了国家专利。首先,使用Plackett-Burmans实验设计法对碳源、氮源和无机盐进行产酶显著性的分析,培养基组分对β-葡萄糖苷酶生产影响排序为：TCS>KH2PO4> SM=（NH4）2SO4;然后应用计算机辅助模型拟合的方法对培养基进行进一步的优化,建立的模型包括响应面法和人工智能,人工智能模型表现的非常优异,得到的最佳培养基组成为：TCS 26.274 g/L,SM 7.066 g/L, KH2PO41.991 g/L, （NH4）2SO42.328 g/L,其它成分保持原始值,30℃,初始pH值为5时,发酵8天,此时发酵生产的β-葡萄糖苷酶活力可以达到2.714U/mL。接下来对Tolypocladium cylindrosporum syzx4发酵生产的β-葡萄糖苷酶进行纯化、性质分析、糖化和同步糖化发酵气爆玉米秸秆的应用研究。酶的纯化过程采用的是硫酸铵沉淀法,DEAE-52纤维素离子交换法和Sephadex G-100凝胶层析法。纯化后相对于纯化前的粗酶液活力提高了9.47倍,回收率为12.27%,得到的酶活力为40.50U/mL。SDS-PAGE结果显示为分子量为58.6 kDa的一条带,表明达到了电泳纯,Native-PAGE的结果表明此β-葡萄糖苷酶表现出良好的生物活性。酶学性质分析以β-葡萄糖苷酶对常用的三种水解底物为对象即纤维二糖,水杨素和p-NPG,研究了酶的水解性质,水杨素为底物时Km为8.8 mmoL/L Vmax为25.6 mmoL/s和Kcat为53.89 s-1；以纤维二糖为底物时得到Km为2.59mmoL/L、Vmax为45.3 mmoL/s和Kcat为95.37s-1；对硝基苯-β-D葡萄糖苷（p-NPG）为底物时得到Km为0.85 mmoL/Lmax为85.23 mmoL/s和Kcat为179.43s-1；以p-NPG为底物时,酶对葡萄糖的抑制常数Ki为3.95 mmoL/L,对葡萄糖醛酸内酯的抑制常数Ki为13.29μmol/L,β-葡萄糖苷水解酶具有较强的耐受葡萄糖和葡萄糖醛酸内酯的的性能,温度和pH值对酶活性的影响分析表明广泛的温度适应性在35到70℃反应时酶活性保留了85%以上；该酶耐酸性很强,在pH值为3.0时活力比标准测定方法提高了20%,在酸性条件下比中性条件下稳定。最后,研究了此β-葡萄糖苷酶和其它商业化的纤维素酶复配对气爆秸秆糖化和同步糖化发酵方面的应用,经过单因子方法设计和统计学分析优化,确定糖化条件为：基质浓度为3.05%、糖化pH值为3.73、糖化温度为43.38℃和酶配比中β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的比例为0.91时,糖化率达到88.41%；同步糖化发酵结果证明,添加Novo-188商业化β-葡萄糖苷酶的乙醇产量比不添加β-葡萄糖苷酶的提高了50.4%,比添加同等酶活力的商业化Novo-188β-葡萄糖苷酶的乙醇产量提高了32.9%。添加Syzx4苷酶比不添加苷酶乙醇产量提高了一倍。添加Syzx4生产乙醇的速率方面也明显的优于其它两种反应体系。48h乙醇产量已经接近了17.5g/L,120h连续发酵乙醇产量可以达到23.8g/L。本研究结果表明无论是在气爆秸秆的糖化过程还是在同步糖化发酵过程中,此β-葡萄糖苷酶都表现出优异的性能,具有广阔的应用前景,证实了从腐败玉米秸秆中分离得到的Tolypocladium cylindrosporum syzx4菌株为开发新型β-葡萄糖苷酶制剂提供了应用基础和理论研究。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 第一章 前言
• 1.1 β-葡萄糖苷酶
• 1.1.1 β-葡萄糖苷酶简介
• 1.1.2 β-葡萄糖苷酶的定义和分类
• 1.1.3 β-葡萄糖苷酶的来源与制备
• 1.1.3.1 β-葡萄糖苷酶来源的研究
• 1.1.3.2 β-葡萄糖苷酶制备的研究
• 1.1.3.3 β-葡萄糖苷酶纯化的研究
• 1.1.4 β-葡萄糖苷酶的作用
• 1.1.4.1 β-葡萄糖苷酶在哺乳动物中的作用
• 1.1.4.2 β-葡萄糖苷酶在昆虫中的作用
• 1.1.4.3 β-葡萄糖苷酶在植物中的作用
• 1.1.4.4 β-葡萄糖苷酶在微生物中的作用
• 1.1.5 β-葡萄糖苷酶的生物化学性质
• 1.1.5.1 β-葡萄糖苷酶的结构研究
• 1.1.5.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制研究
• 1.1.5.3 β-葡萄糖苷酶的底物结合特异性的研究
• 1.1.5.4 β-葡萄糖苷酶水解底物时酶学动力学参数的研究
• 1.1.5.5 β-葡萄糖苷酶的抑制剂和协同作用因子
• 1.1.5.6 β-葡萄糖苷酶的pH值和温度稳定性
• 1.1.6 β-葡萄糖苷酶活力测定方法
• 1.2 ITS序列在真菌种属鉴定中的应用
• 1.2.1 rDNA及其相关信息
• 1.2.2 ITS序列的获取和应用
• 1.3 燃料乙醇的研究进展
• 1.3.1 燃料乙醇的研究综述
• 1.3.2 我国纤维质乙醇的发展现状
• 1.3.2.1 我国目前乙醇工业的状态
• 1.3.2.2 我国的木质纤维素乙醇技术
• 1.3.2.3 酶水解技术在纤维乙醇生产中的应用
• 1.3.2.4 纤维质乙醇的发酵工艺
• 1.3.2.5 纤维质乙醇的发展趋势
• 1.4 计算机辅助模型在过程优化中的应用
• 1.4.1 单因子实验法
• 1.4.2 计算机相关的实验设计方案
• 1.4.2.1 正交实验设计法
• 1.4.2.3 响应面法
• 1.4.2.4 人工智能方法在过程优化中的应用
• 1.5 本文研究的意义
• 1.6 本文研究的主要内容
• 第二章 新型β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选、鉴定和发酵条件的模拟优化
• 2.1 引言
• 2.2 试剂和材料
• 2.2.1 常用的试剂和仪器
• 2.2.2 培养基及其组成成分
• 2.2.2.1 富集培养培养基
• 2.2.2.2 初筛培养基
• 2.2.2.3 纤维二糖诱导培养基
• 2.2.2.4 产酶培养基
• 2.3 仪器设备
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 初筛和菌株保存
• 2.4.2 复筛和菌株保存
• 2.4.2.1 种子液的制备
• 2.4.2.2 酶活力复筛和菌株保存
• 2.4.3 β-葡萄糖营酶活力测定
• 2.4.4 syzx4菌株的显微形态的初步鉴定
• 2.4.5 syzx4菌株的分子生物学的鉴定
• 2.4.5.1 syzx4菌株基因组的提取和ITS序列的测定
• 2.4.5.2 syzx4菌株的鉴定
• 2.4.6 以工农业废料为碳源和氮源生产β-葡萄糖苷酶
• 2.4.7 菌株的基本培养条件
• 2.4.8 测定酶活力
• 2.4.9 酶活力生产曲线的测定
• 2.4.10 Plackett-Burman实验设计在产酶培养基优化中的应用
• 2.4.11 响应面分析法
• 2.4.13 人工智能技术在syzx4菌株发酵培养基优化中的应用
• 2.4.14 syzx4菌株发酵条件优化结果
• 2.4.14.1 摇瓶转速对β-葡萄糖苷酶发酵生产的影响
• 2.4.14.2 发酵温度对β-葡萄糖苷酶发酵生产的影响
• 2.4.14.3 培养基初始pH值对β-葡萄糖苷酶发酵生产的影响
• 2.5 实验结果
• 2.5.1 β-葡萄糖苷酶生产菌株粗筛结果
• 2.5.2 syzx4菌株的形态和分子生物学鉴定结果
• 2.5.2.1 syzx4菌株的显微形态分析结果
• 2.5.2.2 syzx4菌株分子生物学鉴定结果
• 2.5.3 syzx4菌株培养基优化结果
• 2.5.3.1 单因子筛选碳、氮源
• 2.5.3.2 酶活力和生产率曲线的测定
• 2.5.3.3 Plackett-Burman实验影响β-葡萄糖苷酶产量因子评价结果
• 2.5.3.4 中心组合设计法优化培养基
• 2.5.4 人工智能技术对syzx4菌株发酵培养基优化的结果
• 2.5.4.1 发酵过程人工神经网络模型的建立
• 2.5.4.2 遗传算法相结合的人工神经网络发酵模型的优化
• 2.5.5 syzx4发酵条件的优化的结果
• 2.5.5.1 摇瓶转速对β-葡萄糖苷酶发酵的影响
• 2.5.5.2 温度对β-葡萄糖苷酶发酵的影响
• 2.5.5.3 pH值对β-葡萄糖苷酶发酵的影响
• 2.6 本章总结
• 第三章 β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质研究
• 3.1 实验试剂和仪器
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶的分离纯化过程
• 3.2.1.1 粗酶液的制备
• 3.2.1.2 硫酸铵分级分离法
• 3.2.1.3 缓冲液回溶沉淀
• 3.2.1.4 DEAE-52纤维素离子柱层析
• 3.2.1.5 Sepharose G-100凝胶柱层析
• 3.2.2 分离纯化过程中蛋白质含量的测定
• 3.2.3 酶活力的测定
• 3.2.4 β-葡萄糖苷酶分子量和活性的分析
• 3.2.4.1 Native-PAGE确定β-葡萄糖苷酶的活性
• 3.2.4.2 SDS-PAGE确定β-葡萄糖苷酶分子量
• 3.2.5 β-葡萄糖苷酶的基本性质解析
• 3.2.5.1 最适温度和温度稳定性研究
• 3.2.5.2 β-葡萄糖苷酶的最适pH和pH稳定性
• 3.2.5.3 各种添加剂对β-葡萄糖苷酶活性的影响
• 3.2.5.4 β-葡萄糖苷酶基质特异性的研究
• 3.2.5.5 β-葡萄糖苷酶纤维素结合能力的研究
• 3.2.5.6 β-葡萄糖苷酶酶学动力学参数的研究
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 硫酸铵沉淀结果
• 3.3.2 DEAE-52纤维素离子柱层析结果
• 3.3.3 Sepharose G-100凝胶柱层析的结果
• 3.3.4 β-葡萄糖苷酶一般性质的研究结果
• 3.3.4.1 β-葡萄糖苷酶活性电泳分析
• 3.3.4.2 β-葡萄糖苷酶分子量和纯度的确定
• 3.3.5 最适温度和温度稳定性实验结果
• 3.3.5.1 β-葡萄糖苷酶最适温度实验结果
• 3.3.5.2 β-葡萄糖苷酶热稳定性的实验结果
• 3.3.6 最适pH值和pH值稳定性的实验结果
• 3.3.6.1 β-葡萄糖苷酶最适pH值的实验结果
• 3.3.6.2 β-葡萄糖苷酶pH值稳定性实验结果
• 3.3.7 各种添加剂对β-葡萄糖苷酶活性影响
• 3.3.7.1 不同金属离子和部分溶剂对β-葡萄糖苷酶活力影响
• 3.3.7.2 实验室常用有机溶剂对β-葡萄糖苷酶活力影响
• 3.3.8 β-葡萄糖苷酶基质特异性的研究
• 3.3.9 β-葡萄糖苷酶与纤维素结合能力的分析
• 3.3.10 酶反应过程中动力学参数实验结果
• 3.3.10.1 常用底物对β-葡萄糖苷酶学性质研究
• 3.3.10.2 以p-NPG为底物对常用的酶抑制剂研究结果
• 3.4 本章总结
• 3.4.1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化过程总结
• 3.4.2 β-葡萄糖苷酶的基本性质总结
• 3.4.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质的总结
• 第四章 β-葡萄糖苷酶在玉米秸秆糖化和同步糖化发酵中的应用
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂和仪器
• 4.1.3 酶的来源
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 内切酶活力的测定方法
• 4.2.2 滤纸酶活力的测定
• 4.2.3 β-葡萄糖苷酶活力测定
• 4.2.4 术聚糖酶的活力
• 4.2.4.1 桦木木聚糖酶活力测定
• 4.2.4.2 橡树木聚糖酶活力测定
• 4.2.5 蛋白含量的测定
• 4.2.6 发酵底物和处理方法
• 4.2.6.1 糖化和发酵的底物基质
• 4.2.6.2 农业废料玉米秸秆的预处理
• 4.2.7 秸秆的纤维质含量的测定方法
• 4.2.7.1 秸杆纤维素含量测定
• 4.2.7.2 秸秆半纤维素含量测定
• 4.2.8 糖化过程的研究方法
• 4.2.9 气爆制备的秸秆的成分分析和形态结构
• 4.2.9.1 气爆秸杆的成分分析
• 4.2.9.2 玉米秸秆和气爆秸秆的形态结构的比较
• 4.2.10 秸秆糖化条件的优化
• 4.2.10.1 单因子方法
• 4.2.10.2 响应面分析方法
• 4.2.11 同步糖化发酵
• 4.2.11.1 秸杆的预处理
• 4.2.11.2 乙醇含量的测定
• 4.2.11.3 接种酵母的活化
• 4.2.11.4 同步糖化发酵过程
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 纤维素酶活力的解析
• 4.3.2 不同预处理秸秆糖化的结果
• 4.3.3 气爆秸杆的成分和形态结构的分析
• 4.3.3.1 气爆秸杆成分分析结果
• 4.3.3.2 气爆秸杆形态结构分析结果
• 4.3.4 添加syzx4β-葡萄糖苷酶对秸秆糖化作用的研究
• 4.3.4.1 单因子实验优化气爆秸秆糖化过程
• 4.3.4.2 RSM分析法在纤维素酶糖化秸杆过程中的应用
• 4.3.5 同步糖化发酵实验结果
• 4.4 本章总结
• 4.4.1 不同预处理方法糖化结果的总结
• 4.4.2 糖化条件研究的结果总结
• 4.4.3 同步糖化发酵研究总结
• 第五章 工作总结和展望
• 5.1 工作总结
• 5.2 本研究的创新之处
• 5.3 后续工作建议
• 参考文献
• 攻读学位期间的科研成果
• 致谢