论文摘要
一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种气体自由基,广泛存在于各组织器官的各种细胞中,参与循环系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和免疫系统等多种生理和病理过程。在雌性生殖系统中,NO参与卵泡的发育、卵母细胞的成熟、排卵、黄体退化、受精、胚胎着床、维持妊娠、调节分娩、月经周期的调控等一系列生殖过程。NO对颗粒细胞作用的研究主要集中在鼠(包括人)上,在其他动物上报道不多。本论文以猪为对象,研究了NO对颗粒细胞凋亡和细胞周期的影响,对卵母细胞成熟及发育能力的影响,以及与激素的相互调节的作用。用不同浓度的NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)(0mM,0.01mM,0.1raM,1mM)处理贴壁的壁颗粒细胞和卵丘卵母细胞复合体(COCs)。培养结束后,观察细胞的形态,检测细胞的凋亡、细胞周期和培养液中的激素含量,检查卵母细胞的成熟率并孤雌激活后观察胚胎的发育情况。结果发现,0.01mM SNP对培养细胞的生长形态没有影响,0.1mM和1mM SNP能促使贴壁的细胞收缩,且形态不规则,促使培养后消化的细胞表面粗糙,细胞膜呈现出许多小泡状突起。0.01mM SNP可降低2mm和4mm卵泡壁颗粒细胞的凋亡率,对卵丘细胞的凋亡没有影响。0.1mM和1mM促进了2mm和4mm卵泡壁颗粒细胞和卵丘细胞凋亡。NO对不同细胞类型和壁颗粒细胞的不同发育阶段凋亡的影响不一样:卵丘细胞凋亡率低于2mm壁颗粒细胞(P＜0.05),2mm壁颗粒细胞凋亡率低于4mm壁颗粒细胞(P＜0.05)。1mM SNP对凋亡作用最明显(P＜0.05),在2mm卵泡壁颗粒细胞达到55%,比对照组高出47个百分点,在4mm比对照组高出42个百分点,在卵丘细胞其凋亡率达到9%,比对照组降低8个百分点。SNP能剂量依赖性降低2mm,4mm卵泡壁颗粒细胞和卵丘细胞G0/G1期细胞,在2mm和4mm卵泡可分别由对照组的84%降到1mM的32%,对照组的76%降到1mM的31%,但0.01mM在4mm卵泡壁颗粒细胞和卵丘细胞与对照组相比,差异不显著。SNP可增加S期和G2/M期细胞的比率,以1mM作用最明显(P＜0.05)。0.1mM和1mM SNP能抑制2mm和4mm卵泡壁颗粒细胞雌二醇的分泌作用(P＜0.05)。1mM SNP能抑制2mm和4mm卵泡壁颗粒细胞孕酮的分泌作用(P＜0.05)。与对照组相比,0.01mM SNP提高了受冷刺激的卵母细胞的成熟率(P＜0.05),由15%提高到18%,但对后期孤雌胚的发育没有影响。0.1mM和1mM组降低了卵母细胞的成熟率和孤雌胚的卵裂率,这两组的胚胎没有发育到桑囊胚的。以上结果表明,猪卵巢上卵泡内颗粒细胞体外培养时,NO会影响颗粒细胞的形态、凋亡、细胞周期和类固醇激素的分泌,且作用随着NO水平的变化表现出很大的差异。高浓度的NO使颗粒细胞的形态发生异常,低水平NO则不会;高水平的NO促进颗粒细胞的凋亡,低水平则有抑制作用;NO还能剂量依赖性地降低G0/G1期颗粒细胞的比例,增加S期和G2/M期的比率;高浓度的NO抑制颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮;高浓度的NO会对卵泡内卵母细胞产生明显的损伤。对于直径2mm和4mm的卵泡内的颗粒细胞,NO的上述作用基本相近。