基于快速分离、高灵敏度检测的毛细管电泳优化方法研究与应用

论文摘要

毛细管电泳技术以其高效、快速、微量、经济、应用面广等优点,受到了世界范围的广泛重视,在化学、药学和生命科学等领域均得到了广泛深入的发展。本文旨在构建“快速、高灵敏度、高通量”的分析策略,建立基于快速分离、高灵敏度检测的毛细管电泳优化方法,并将其应用到药物质量控制和新药的药代动力学研究中。全文由四章组成。第一章是概述。分别介绍了毛细管电泳的发展现状和发展热点,并在此基础上提出本文的立题依据和研究内容。第二章是以右旋苯丙胺和苯海拉明为研究对象,建立了快速毛细管区带电泳方法用于速效抗晕胶囊的质量控制。分别对内标选择、进样模式、pH、缓冲液组成及浓度和分离电压等影响因素作了系统的研究。使用未涂布熔融石英毛细管柱40.2 cm×75μm i.d.,有效长度30 cm,运行缓冲液为50 mmol/LNaH2PO4-12.5mmol/L硼砂缓冲液（pH 5.5）,柱温为25℃,运行电压为20 kV（+）→（-）,电迁移进样10 kV×4 s,检测波长为200 nm。右旋苯丙胺、苯海拉明和内标氨氯地平的迁移时间分别为1.45、1.56和1.67 min,每个样品分析周期为2.0 min。与常规高效液相色谱质量控制方法相比,分析时间至少缩短了3 min,提高了样品分析的速度。第三章是以右旋苯丙胺和苯海拉明为对象,利用场放大技术,建立高灵敏度的毛细管区带电泳方法应用于速效抗晕胶囊的临床前药代动力学研究。通过考察样品溶剂的组成、缓冲液的浓度、缓冲液的组成和进样时间等因素的改变对于场放大结果的影响,确定了Beagle犬血浆中右旋苯丙胺和苯海拉明的CZE-FASS条件。在3.5 min内完成分离分析,生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定。右旋苯丙胺、苯海拉明和内标氨氯地平在血浆样品中的富集倍数为48、67和43倍。与文献报道LC/MS/MS方法进行比较,结果表明CZE-FASS方法的LLOQ（右旋苯丙胺和苯海拉明均为2 ng/mL）虽略高于LC/MS/MS方法（右旋苯丙胺0.5 ng/mL,苯海拉明1 ng/mL）,但已完全满足体内样品测定的要求,其他参数均与LC/MS/MS方法相当。对于一般采用串联质谱检测才能够获得的快速分析,采用CZE-FASS方法同样可以实现生物样品的高灵敏度快速分析,成为一种低廉、环保、有效的替代方法,已成功应用于速效抗晕胶囊的临床前药代动力学研究。第四章是以普卢利沙星代谢产物NM394为研究对象,建立了高通量96孔固相萃取-毛细管区带电泳方法对普卢利沙星进行临床药代动力学研究。由于样品前处理成为体内药物分析方法中最大的限速环节,故对前处理进行了方法学的改进和优化,采用96孔板模式对生物样品进行纯化,提高了单位时间内样品的通量,实现了大规模样品前处理和毛细管电泳快速分离的高通量分析。建立的96孔板固相萃取-毛细管电泳测定人血浆中NM394的方法,与现有的方法相比,提高了样品前处理通量,缩短了分析周期。用非房室模型法估算相应的药代动力学参数,与高效液相色谱-荧光检测法所得参数相比较,两者无显著性差异。结果证明了毛细管区带电泳对血浆中普卢利沙星活性代谢物NM394浓度水平的跟踪有足够的选择性,能够实现普卢利沙星片临床药代动力学研究中大量样品的快速准确分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 概述
• 1 毛细管电泳的发展现状
• 1.1 毛细管电泳仪器
• 1.2 毛细管电泳的常见分离模式
• 1.3 毛细管电泳的应用特点
• 1.4 毛细管电泳存在的问题
• 2 毛细管电泳的发展热点
• 2.1 快速分离分析
• 2.2 高灵敏度检测方法
• 3 立题依据与研究内容
• 参考文献
• 第二章 快速毛细管区带电泳测定速效抗晕胶囊中右旋苯丙胺和苯海拉明
• 1 前言
• 2 实验
• 2.1 仪器
• 2.2 试药
• 2.3 电泳条件
• 2.4 液相色谱条件
• 2.5 标准溶液和样品溶液
• 2.6 方法验证
• 3 结果与讨论
• 3.1 内标选择
• 3.2 进样模式的选择
• 3.3 缓冲液pH值的影响
• 3.4 缓冲液浓度的影响
• 3.5 运行电压的影响
• 3.6 分离效能
• 3.7 方法学验证
• 3.8 药物制剂中的分析
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 毛细管区带电泳-场放大堆积方法测定Beagle犬血浆中的右旋苯丙胺和苯海拉明
• 1 前言
• 2 实验
• 2.1 仪器
• 2.2 试药
• 2.3 电泳条件
• 2.4 样品溶液的配制
• 2.5 血样处理与测定
• 2.6 单剂量给药药代动力学研究
• 3.结果与讨论
• 3.1 CZE-FASS条件优化
• 3.2 方法学验证
• 3.3 血浆样品测定结果
• 4.结论
• 参考文献
• 第四章 采用高通量毛细管区带电泳方法分析人血浆中普卢利沙星活性代谢物NM394的浓度
• 1 前言
• 2 实验
• 2.1 仪器
• 2.2 试药
• 2.3 电泳条件
• 2.4 样品溶液的配制
• 2.5 血样处理与测定
• 2.6 单剂量给药药代动力学研究
• 3.结果与讨论
• 3.1 电泳条件优化
• 3.2 前处理条件优化
• 3.3 方法学验证
• 3.4 血浆样品测定结果
• 4 结论
• 参考文献
• 结语
• 致谢
• 在读期间发表论文和参加科研工作的情况说明
• 附录一
• 附录二
• 附录三