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GLSBr系列化合物的药代动力学特征及其吸收转运机制的研究

2020-12-03阅读(614)

GLSBr系列化合物的药代动力学特征及其吸收转运机制的研究

论文摘要

背景和目的:临床广泛应用的抗HBV药多是核苷类化合物,其耐药性和停药复发率日趋明显。GLSBr是化学合成的非核苷类系列化合物,它在动物体内外试验中已呈现抗HBV的全新作用机制和令人瞩目的效应。然而至少有40%的新化合物是因其吸收、分布、代谢及排泄特性的不理想而被淘汰。因此,探明GLSBr系列化合物的药代特征及吸收机制是其能否成为创新抗HBV药物的关键所在。本文旨在试验研究GLSBr系列化合物的药代动力学特征,探明其优势化合物的吸收机制,为GLSBr系列化合物的优选和研发提供试验和理论依据。方法:1.首先摸索和建立RP-HPLC检测GLSBr系列化合物生物样本的方法,并进行系统的方法学考察。选取48只SD大鼠,随机分为12组,分别灌胃或尾静脉注射高低二个剂量组的GLSBr-1、GLSBr-2和GLSBr-3溶液,于给药前和给药后自大鼠球后静脉丛取系列血样,采用RP-HPLC检测血中GLSBr浓度。运用DAS2.0软件求算GLSBr系列化合物的主要药动学参数。2.另取24只SD大鼠,随机分为6组,分别经尾静脉注射GLSBr-1、GLSBr-2和GLSBr-3溶液,于给药后10min、2h断头处死,取血及肝、肾、脑组织。RP-HPLC测定GLSBr系列化合物的组织浓度。3.对RP-HPLC测试出的GLSBr-3可疑代谢产物选用LC-MS-MS定性分析代谢物的基本结构,并摸索和建立GLSBr-3原形和代谢物的LC-MS检测方法,定量测定和分析比较血浆与组织中GLSBr-3原形和该代谢产物浓度的差异性。4.建立并全面评价Caco-2单层细胞模型的特性,采用该Caco-2细胞模型试验观察优选的GLSBr-3吸收和转运过程;考察时间、底物浓度、体系温度、培养介质PH值以及P-gp抑制剂Ver对GLSBr-3在Caco-2细胞中摄取的影响; RP-HPLC测定Caco-2细胞内外GLSBr-3的浓度。并运用SPSS12.0、Excel 2003软件分析和统计处理细胞试验所得的数据,探讨GLSBr-3在Caco-2细胞摄取和转运的方式。结果:1.建立的血浆样本和组织样本RP-HPLC/LC-MS检测方法具有较高的灵敏度和专属性,方法学考察结果符合生物样本分析的要求。2.GLSBr-1和GLSBr-2的体内过程符合二室模型;当80mg/kg GLSBr-1,11mg/kg GLSBr-2时,符合一级动力学过程, GLSBr-1和GLSBr-2在大鼠体内的t1/2z分别为4.56±1.67h和0.95±1.21h;且GLSBr-1在体内停留的时间明显比GLSBr-2长（P<0.05）;而GLSBr-3在RP-HPLC检测条件下无法测出。3.静注不同剂量的GLSBr-1和GLSBr-2在肝、肾组织中均能测得浓度,其中肝浓度最高:为1.25±0.23和0.61±0.27μg·mL-1;肾浓度其次:为0.51±0.37和0.26±0.08μg·mL-1;GLSBr-1在脑中测得的浓度为0.34±0.10μg·mL-1,而GLSBr-2在脑组织中无法测到。这种组织分布特点有利于GLSBr-1和GLSBr-2在肝中发挥药物作用。4.在大鼠血浆中,RP-HPLC检测未显示GLSBr-3色谱峰,但却稳定的出现另一与浓度密切相关的可疑代谢峰,经LC-MS-MS分析测试,该代谢产物是GLSBr-3由C21H22N4O3FSBr分子酯键水解为C19H18N4O3FSBr而来。LC-MS检测结果表明,虽然小鼠血浆中GLSBr-3的此代谢物浓度高于原形药浓度;但小鼠肝、肾组织中GLSBr-3的浓度却明显高于代谢物,且GLSBr-3在肝中浓度最高:0.79±0.08μg·mL-1,持续时间长达8h以上,表明GLSBr-3具有肝趋向分布的优势。5.Caco-2细胞摄取GLSBr-3随着时间的增加而增多,在浓度为6.25～50μg/mL范围内,随着GLSBr-3浓度的增加摄取量呈线性递增,未出现饱和现象,但温度对GLSBr-3的摄取量有着显著的影响（P<0.05）,PDR值为1.335±0.141,这提示Caco-2细胞摄取GLSBr-3有被动扩散与主动转运两种方式。因为P-gp的特异性抑制剂维拉帕米不能影响GLSBr-3的摄取,所以GLSBr-3可能不是P-gp的底物。结论:建立的GLSBr系列化合物及代谢物的RP-HPLC/LC-MS检测方法可用于本试验研究;GLSBr-1和GLSBr-2在大鼠体内的药代动力学过程符合二室模型特征,GLSBr系列化合物在大鼠组织中的分布特点是肝>肾>脑,这有利于其在肝中发挥抗HBV作用;虽然GLSBr-3在体内迅速由酯键水解生成代谢物C19H18N4O3FSBr,但小鼠肝中GLSBr-3的浓度却明显高于代谢物,且GLSBr-3在肝中停留时间很长,基于GLSBr-3抗HBV效应优势和肝趋向分布特征,其很可能成为GLSBr系列中最有研发潜力的化合物;GLSBr-3的吸收和转运是被动扩散和主动转运共同参与的。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 引言
  • 第2章 GLSBr 系列化合物动物体内药代动力学研究
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 试验动物和给药方法
  • 2.2 生物样品的采集
  • 2.2.1 灌胃时血浆样品的采集
  • 2.2.2 静脉注射时血浆样品的采集
  • 2.2.3 组织样品的采集
  • 2.3 仪器和试剂
  • 2.4 标准溶液的配制
  • 2.5 生物样品色谱条件
  • 2.6 生物样品处理方法
  • 2.7 GLSBr 系列化合物的溶解度及给药剂量的摸索
  • 2.8 统计与图表
  • 2.9 结果
  • 2.9.1 GLSBr 系列化合物溶解度结果
  • 2.9.2 GLSBr 系列化合物的给药剂量试验结果
  • 2.9.3 RP-HPLC 方法的专属性
  • 2.9.4 标准曲线的线性范围及检出限
  • 2.9.5 方法回收率和精密度
  • 2.9.6 GLSBr 系列化合物进入大鼠体内的血药浓度情况
  • 2.9.7 GLSBr 系列化合物大鼠体内主要药代动力学参数
  • 2.9.8 大鼠尾静脉注射GLSBr系列化合物的组织分布
  • 2.9.9 GLSBr-3 在动物体内代谢产物的发现
  • 2.9.10 GLSBr-3小鼠体内的代谢物过程
  • 2.10 讨论
  • 第3章 Caco-2 细胞模型中的 GLSBr-3吸收机制的研究
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 细胞株
  • 3.1.2 主要试剂、药品及试液的组成
  • 3.1.3 主要仪器
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 Caco-2 细胞培养
  • 3.2.2 色谱条件
  • 3.2.3 Caco-2 细胞样品处理
  • 3.3 Caco-2 细胞模型完整性验证
  • 3.3.1 Caco-2 细胞形态
  • 3.3.2 Caco-2 细胞电镜下观察
  • 3.3.3 跨上皮细胞电阻（TEER）的检测
  • 3.4 Caco-2 细胞对GLSBr-3 对 Caco-2 细胞增殖抑制作用
  • 3.4.1 Caco-2 细胞蛋白含量测定（考马期亮蓝法）
  • 3.4.2 MTT 法检测 GLSBr-3 对 Caco-2 细胞增殖抑制作用
  • 3.4.3 Caco-2 细胞摄取试验
  • 3.4.4 GLSBr-3 在 Caco-2 细胞模型中转运试验
  • 3.5 统计分析
  • 3.6 讨论
  • 第4章 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附图
  • 综述
  • 攻读学位期间的研究成果

    • 相关论文文献

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