论文摘要
目的筛选在人皮肤黑素瘤中表达的已知hsa-microRNA,根据筛选结果,探讨相应的hsa-microRNA在该疾病中的功能,为阐明黑素瘤发病机制、寻求有效的治疗途径提供理论和实验依据。方法采用SBC microRNA芯片技术,将6例人皮肤黑素瘤组织总RNA分别与9例健康人色素痣总RNA的混合物对比,筛选其中已知的468条hsa-microRNA表达情况。根据生物信息学的有关方法处理芯片实验数据,筛选出共同差异表达的候选hsa-microRNA。采用荧光实时定量PCR的方法,分别检测这6例人皮肤黑素瘤组织中的各候选hsa-microRNA的表达情况。将芯片和qPCR两种方法结论一致的候选hsa-microRNA确定为有意义的共同差异表达hsa-microRNA。检测表达差异最明显的hsa-microRNA在A375和M14细胞系中的表达情况。采用microRNA-21 inhibitor脂质体瞬时转染黑素瘤细胞系,设立对照组,并设立microRNA-21 inhibitor 90nmol/L、180 nmol/L、270 nmol/L三个浓度,分别用CCK-8试剂盒检测细胞活性变化,并分析该浓度与细胞活性之间的关系。将活性变化最明显的一组细胞系用FCM术检测细胞周期与细胞凋亡的改变,同时用RT-PCR法检测其中的BRAF和p27基因mRNA表达水平。结果1、此6例人皮肤黑素瘤中miRNA-21明显上调表达,miRNA-320和miRNA-494明显下调表达。2、黑素瘤细胞系A375和M14中均有miRNA-21不同程度的表达。3、将miRNA-21 inhibitor转染A375和M14细胞,当抑制剂浓度为90nmol/L时,细胞活性受到明显抑制;提高抑制剂浓度,A375细胞活性受到进一步抑制,且二者之间存在相关性。4、经转染miRNA-21 inhibitor且细胞活性发生明显抑制的A375细胞,其G1期细胞比率明显增高,而S期细胞比率明显降低,细胞凋亡比率增高。5、经转染miRNA-21 inhibitor且细胞活性发生明显抑制的A375细胞中的BRAF基因和p27基因mRNA表达水平没有明显变化。结论运用miRNA芯片技术,首次发现人皮肤黑素瘤组织中miRNA-21明显上调表达,miRNA-320和miRNA-494明显下调表达。miRNA-21在黑素瘤细胞中抑制细胞凋亡、促进细胞增殖,可能起原癌基因样的作用。miRNA-21对BRAF和p27基因的mRNA表达水平无明显影响。