猪生长激素单克隆抗体的制备及应用

论文摘要

猪生长激素（porcine growth hormone，pGH）又称猪促生长素（porcine somatotropin，pST），是由猪脑垂体前叶以脉冲方式分泌的约191个氨基酸的肽类激素，是调节猪正常生长和发育的主要激素之一。它能促进葡萄糖吸收、核酸与蛋白质的合成以及脂肪的分解，提高猪的生长速度，饲料报酬和瘦肉率。 近年来随着杂交瘤技术的发展及pGH单克隆抗体的成功制备，为建立pGH ELISA测定技术提供了可能。酶联免疫吸附测定法（ELISA）由于具有无放射性污染、特异性强、灵敏度高、测定周期短、对实验室条件要求不高等许多优点，因而受到人们的普遍关注和重视。灵敏的ELISA检测方法的建立，为开展猪生长发育及生殖的GH调控及GH基因转移和表达的研究提供了一种行之有效的GH检测手段，对内分泌学的研究进程具有重要意义和应用价值。 本试验采用猪生长激素（pGH）免疫家兔制备了抗血清，经饱和硫酸铵粗提得到兔抗pGH的IgG抗体，SDS-PAGE鉴定抗体的纯度，紫外分光光度计测定蛋白含量达到21mg／mL；选取BALB／c小鼠，以猪生长激素纯品为抗原，进行免疫，脾细胞与sp2／0细胞融合筛选杂交瘤细胞。获得了三株稳定分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株，分别为3B12、2D4和2G11。和本课题组以前保存的其他三株单抗（1A3、1A5和1B5）同时进行效价、亲和力、Ig亚类及抗原识别位点等特性的鉴定，筛选出一株亲和力和效价都较好的单克隆抗体（1A3）。 双抗体夹心法采用一株抗pGH的单克隆抗体（1A3）为包被抗体，以识别和结合待检标本中的pGH，兔抗pGH多抗可与pGH分子的另外表位结合，后加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的山羊抗兔IgG作为酶标抗体，并催化底物显色，根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本中的pGH含量，成功地建立了pGH的双抗体夹心ELISA法。标准品中pGH含量在15.62ng／mL～1.0μg／mL范围内，浓度对数与其OD490nm值呈线性关系，最低检测限为7.81ng／mL。此方法具有快速、灵敏、特异的特点。 本研究意在利用猪生长激素纯品去免疫BALB／c小鼠，进而构建具有稳定分泌猪生长激素单抗的杂交瘤株，再利用猪生长激素单克隆抗体建立一种快速、灵敏、特异的检测猪血液及组织中生长激素的方法，进行品种间比较，为动物的品种选育提供参考指标，并为其早期育种提供依据，还可以为猪生长激素节律性分泌的机理研究奠定理论和物质基础。

论文目录

• 前言
• 实验一 猪生长激素单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果
• 2.1 细胞融合及筛选
• 2.2 单抗腹水及培养上清效价的测定
• 2.3 免疫球蛋白Ig的亚类鉴定
• 2.4 杂交瘤细胞染色体核型分析
• 2.5 单克隆抗体的纯化
• 2.6 单克隆抗体相对亲和力测定结果
• 2.7 单克隆抗体结合位点的分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 实验二 ELISA检测方法的建立及双抗体夹心检测条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果
• 2.1 兔抗猪生长激素抗血清效价测定
• 2.2 抗血清纯度及含量测定
• 2.3 酶标反应板均一性的测定
• 2.4 抗原包被浓度及单抗最佳使用浓度的确定
• 2.5 单抗包被条件的确定
• 2.6 封闭液和封闭时间的确定
• 2.7 酶标二抗反应浓度的确定
• 2.8 酶标二抗反应时间的确定
• 2.9 双抗体夹心ELISA法检测猪生长激素水平
• 2.10 标准曲线的制作
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介