鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的提取、活性分析及性质研究

论文摘要

鲍鱼,位于海参、鱼翅、鱼肚四大海味之首,不但营养丰富,而且还具有很高的药用价值。而占鲍鱼软组织总重量30～40%左右的脏器则一直作为非食用部分被大量的丢弃或加工成低值的产品,这就大大降低了鲍鱼的价值,还造成了严重的环境污染。本文以鲍鱼脏器为原料,采用常规方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液,探讨最佳提取工艺,研究其最佳的酶活测定条件,将所提取的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液通过盐析、透析、冷冻干燥制成鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末,并对其进行理化分析和酶学特性研究。本论文的主要研究结果如下：1、通过常规提取工艺的单因素试验和正交试验、超声波辅助提取工艺的单因素试验,最后确定了一整套常规方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的工艺。常规提取方法各因素对酶活影响：料液比、缓冲液pH对提取具有显著性的影响（P<0.05）,而浸提时间、缓冲液种类、离心转速对提取的影响不显著。通过常规提取与超声波辅助提取两种方法的比较,可以看出超声波处理有利于鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取。最佳提取工艺条件：缓冲液为0.1mol/L pH 3.5乙酸-乙酸钠,料液比1：4,浸提时间4h,超声时间20min,超声功率200W。2、鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶匀浆液的最佳酶活测定条件：检测波长为400nm,缓冲液为pH 3.50.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸,底物浓度为35mmol/L,反应温度50℃,反应时间30min。3、通过不同盐析剂对鲍鱼脏器匀浆液的盐析效果的影响,确定选择硫酸铵作为鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶分离提取及初步纯化的盐析剂,并且采用分级盐析方法,选择硫酸铵第一个饱和度为30%,第二个饱和度为80%,能够得到更好的分离β-葡萄糖苷酶的效果。4、鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶匀浆液通过分级盐析、辅以透析等初步分离纯化步骤后,比活力均有一定的提高。该技术路线操作简单、回收率高,是一条设计合理的分离纯化β-葡萄糖苷酶的路线。不同的纯化方法所达到纯化效果不尽相同,如果想要达到更高的纯化倍数,可以通过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等方法进一步分离纯化。5、冷冻干燥后的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末呈浅黄色。该β-葡萄糖苷酶粉末中主要成分包括：粗蛋白60.58%,可溶性蛋白29.56%,多糖16.34%,水分10.69%,脂质和灰分几乎不存在。造成多糖含量较高的原因是鲍鱼脏器中含有较多的糖蛋白,盐析过程中伴随着β-葡萄糖苷酶一起沉淀下来。6、冷冻干燥后的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在50℃以下和pH 3.0-6.0范围内,具有较好的热稳定性和pH稳定性,并且能够在4℃冰箱内长时间保存。Zn2+、Cu2+、Ag+对鲍鱼脏器p-葡萄糖苷酶活性有明显的抑制作用；Na+、 K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+对酶活性没有明显的影响；Ba2+、EDTA、Mn2+对酶活均有激活作用,其中,Ba2+、EDTA的激活作用较弱,而Mn2-有较强的激活作用。以p-NPG为底物时,动力学常数分别为Km=4.66mmol/L, Vmax=3.79U/L。7、经SDS-PAGE电泳,透析后的鲍鱼脏器p-葡萄糖苷酶能够达到较高的纯度,分子量大概在54.0-76.0kD。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 鲍鱼及深加工废弃物利用概述
• 1.1.1 鲍鱼简介
• 1.1.2 鲍鱼加工及废弃物利用研究现状
• 1.2 β-葡萄糖苷酶的研究现状
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的简介
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的来源
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶在细胞中的分布
• 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的催化反应
• 1.2.4.1 催化机理
• 1.2.4.2 活性中心结构
• 1.2.4.3 底物特异性
• 1.2.5 β-葡萄糖昔酶的活性测定
• 1.2.5.1 β-葡萄糖苷酶的活性测定方法
• 1.2.5.2 比色法测定β-葡萄糖苷酶活性的研究进展
• 1.2.6 β-葡萄糖苷酶的提取
• 1.2.6.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法
• 1.2.6.2 β-葡萄糖苷酶提取的研究进展
• 1.2.7 β-葡萄糖苷酶分离纯化
• 1.2.7.1 β-葡萄糖苷酶初步纯化
• 1.2.7.2 层析柱纯化β-葡萄糖苷酶
• 1.2.7.3 β-葡萄糖苷酶的纯度分析鉴定
• 1.2.7.4 β-葡萄糖苷酶分离纯化的研究进展
• 1.2.8 β-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.2.8.1 分子量
• 1.2.8.2 最适温度及热稳定性
• 1.2.8.3 等电点pI、最适pH及pH稳定性
• 1.2.8.4 金属离子、抑制剂
• m和V_max'>1.2.8.5 动力学常数K_m和V_max
• 1.3 论文的研究内容及意义
• 1.3.1 本论文研究的主要内容
• 1.3.2 本论文研究的目的和意义
• 第二章 鲍鱼脏器粗β-葡萄糖苷酶的提取
• 前言
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.2.1 试验药品
• 2.1.2.2 试剂的配制
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 实验流程
• 2.2.2 常规方法提取β-葡萄糖苷酶粗酶液
• 2.2.3 超声波细胞粉碎提取β-葡萄糖苷酶粗酶液
• 2.2.4 β-葡萄糖苷酶活性的测定—P-NPG比色法
• 2.2.4.1 原理
• 2.2.4.2 对硝基苯酚标准曲线的绘制
• 2.2.4.3 样品β-葡萄糖苷酶活性的测定
• 2.2.4.4 样品β-葡萄糖昔酶活性的计算
• 2.2.5 常规提取β-葡萄糖苷酶工艺的单因素试验
• 2.2.5.1 缓冲液种类对酶活的影响
• 2.2.5.2 缓冲液pH对酶活的影响
• 2.2.5.3 料液比对酶活的影响
• 2.2.5.4 浸提时间对酶活的影响
• 2.2.5.5 离心转速对酶活的影响
• 2.2.6 常规提取β-葡萄糖苷酶工艺的正交试验
• 2.2.7 验证性实验
• 2.2.8 超声波辅助提取β-葡萄糖苷酶的单因素试验
• 2.2.8.1 超声处理时间对酶活的影响
• 2.2.8.2 超声功率对酶活的影响
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制
• 2.3.2 缓冲液种类对酶活的影响
• 2.3.3 缓冲液PH对酶活的影响
• 2.3.4 料液比对酶活的影响
• 2.3.5 浸提时间对酶活的影响
• 2.3.6 离心转速对酶活的影响
• 2.3.7 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液提取工艺优化
• 2.3.8 鲍鱼脏器β葡萄糖苷酶粗酶液最佳提取工艺的验证
• 2.3.9 超声波辅助提取单因素试验
• 2.2.9.1 超声处理时间对酶活的影响
• 2.2.9.2 超声功率对酶活的影响
• 2.3.10 两种提取方法的比较
• 2.4 小结
• 第三章 鲍鱼脏器粗β-葡萄糖苷酶的活性测定及初步分离纯化
• 前言
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.2.1 试验药品
• 3.1.2.2 试剂的配制
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液活性的测定-P-NPG比色法
• 3.2.1.1 样品β-葡萄糖苷酶活的测定
• 3.2.1.2 单位体积样品β-葡萄糖苷酶活的计算
• 3.2.1.3 样品β-葡萄糖苷酶活的计算
• 3.2.2 蛋白质含量的测定—考马斯亮蓝G-250法
• 3.2.2.1 原理
• 3.2.2.2 蛋白质标准曲线的绘制
• 3.2.2.3 样品中蛋白质含量的测定
• 3.2.2.4 注意事项
• 3.2.3 酶分离、纯化的评价指标
• 3.2.3.1 酶比活力
• 3.2.3.2 酶的回收率
• 3.2.3.3 提纯倍数
• 3.2.4 β-葡萄糖苷酶活性测定条件的优化
• 3.2.4.1 特征吸收波长的选择
• 3.2.4.2 底物浓度的选择
• 3.2.4.3 缓冲液pH的选择
• 3.2.4.4 反应温度的选择
• 3.2.4.5 反应时间的选择
• 3.2.5 不同盐析剂的选择
• 3.2.5.1 氯化钠梯度沉淀
• 3.2.5.2 硫酸铵梯度沉淀
• 3.2.6 硫酸铵饱和度的确定
• 3.2.7 β-葡萄糖苷酶透析脱盐、冷冻干燥
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蛋白质标准曲线的绘制
• 3.3.2 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液最适酶活测定条件
• 3.3.2.1 特征吸收波长的选择
• 3.3.2.2 底物浓度的选择
• 3.3.2.3 缓冲液pH的选择
• 3.3.2.4 反应温度的选择
• 3.3.2.5 反应时间的选择
• 3.3.3 盐析剂的选择
• 3.3.3.1 氯化钠梯度沉淀
• 3.3.3.2 硫酸铵梯度沉淀
• 3.3.4 硫酸铵最佳饱和度的确定
• 3.3.5 β-葡萄糖苷酶的提取纯化结果
• 3.3.6 β-葡萄糖苷酶透析液冷冻干燥
• 3.4 小结
• 第四章 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的成分分析及酶学性质研究
• 前言
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.2.1 试验药品
• 4.1.2.2 试剂的配制
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末的组成成分测定
• 4.2.1.1 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中蛋白质含量的测定
• 4.2.1.2 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中总糖含量的测定
• 4.2.1.3 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中脂质含量的测定
• 4.2.1.4 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中水分含量的测定
• 4.2.1.5 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中灰分含量的测定
• 4.2.2 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末酶学性质研究
• 4.2.2.1 样品β-葡萄糖苷酶活的测定
• 4.2.2.2 温度对酶活性的影响
• 4.2.2.3 酶的热稳定性
• 4.2.2.4 缓冲液pH对酶活性的影响
• 4.2.2.5 酶的pH稳定性
• 4.2.2.6 酶的保存稳定性
• m和V_max的确定'>4.2.2.7 酶催化水解p-NPG动力学常数K_m和V_max的确定
• 4.2.2.8 金属离子和某些抑制剂对酶活性的影响
• 4.2.2.9 纯度鉴定与分子量测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 盐酸标定
• 4.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制
• 4.3.3 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末组成成分测定
• 4.3.3.1 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中蛋白质含量的测定
• 4.3.3.2 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中总糖含量的测定
• 4.3.3.3 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中水分含量的测定
• 4.3.3.4 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末中脂质和灰分含量的测定
• 4.3.4 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶粉末的酶学性质研究
• 4.3.4.1 温度对酶活性的影响
• 4.3.4.2 酶的热稳定性
• 4.3.4.3 pH对酶活性的影响
• 4.3.4.4 酶的pH稳定性
• 4.3.4.5 酶的保存稳定性
• m和V_max的确定'>4.3.4.6 酶催化水解p-NPG动力学常数K_m和V_max的确定
• 4.3.4.7 金属离子和某些抑制剂对酶活性的影响
• 4.3.5 SDS-PAGE电泳纯度鉴定
• 4.3.6 分子量的测定
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢