枯草芽孢杆菌溶栓酶的分离纯化及其酶学性质研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌LD-8547是本实验室分离保存的溶栓酶高产菌株,将具有高溶栓酶活性的枯草芽孢杆菌进行培养,利用（NH4）2SO4沉淀、Sephadex G-100柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,获得了纯度较高的溶栓酶。以四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为该酶的底物,测定了该酶的酶活。测得该酶的最适pH值和温度分别为8.0和45℃,同时显示出亲水性及强溶栓活性。Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe3+对溶栓酶有一定的抑制作用,Mn2+、Ba2+对溶栓酶有较强的抑制作用,Zn2+、Al3+可提高溶栓酶的活性。并研究了几种有机溶剂对其活性的影响,结果表明,甲醇对溶栓酶表现为抑制作用,在10%-15%浓度范围时,其抑制作用明显加强;乙醇在低浓度时对酶活略有激活作用,但随浓度的增大则转变为较强的抑制作用。异丙醇对酶活表现为激活作用,可使酶活提高约70%。利用PCR方法从枯草芽孢杆菌LD-8547的总DNA中扩增出豆豉溶栓（DFE）成熟肽编码区片段。将溶栓酶的编码基因克隆到表达载体pET32a（+）中并转化到E.coli BL21（DE3）中,从而构建了pET32a-DFE重组质粒。IPTG诱导表达大量蛋白,经亲和纯化,得到较纯的重组溶栓酶蛋白。将所得的酶液经过体外抗凝血和溶栓实验,证明该溶栓酶具有明显的溶血栓作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 豆豉溶栓酶的溶栓机制
• 1.2 豆豉溶栓酶的菌种
• 1.3 豆豉溶栓酶的分离纯化
• 1.4 豆豉溶栓酶的理化性质
• 1.4.1 酶的分子量
• 1.4.2 酶的等电点
• 1.4.3 酶的稳定性
• 1.4.4 酰胺水解酶活性
• 1.5 豆豉溶栓酶基因的克隆和表达
• 1.6 豆豉溶栓酶的功能实验
• 1.6.1 体外溶血作用
• 1.6.2 对体外凝血时间（CT）和优球蛋白溶解时间（ELT）的影响
• 1.6.3 体内抗栓、溶栓作用
• 1.7 本项实验的研究意义及应用前景
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 溶栓酶的分离纯化
• 2.2.3 SDS-PAGE分析
• 2.2.4 溶栓酶活性测定
• 2.2.4.1 酶活标准曲线制作
• 2.2.4.2 四肽底物法测酶活
• 2.2.5 蛋白质含量测定
• 2.2.6 溶栓酶性质的研究
• 2.2.7 豆豉溶栓酶成熟肽编码区的PCR扩增和克隆
• 2.2.7.1 枯草芽孢杆菌基因组的提取
• 2.2.7.2 PCR反应
• 2.2.7.3 PCR产物胶回收
• 2.2.7.4 PCR产物与T载体连接
• 2.2.7.5 感受态的制备
• 2.2.7.6 转化
• 2.2.7.7 SDS碱裂解法提取质粒
• 2.2.7.8 目的基因的双酶切
• 2.2.7.9 双酶切DNA片段与表达载体连接
• 2.2.8 蛋白质表达与转化
• 2.2.8.1 蛋白质的表达
• 2.2.8.2 蛋白质的纯化
• 2.2.8.3 SDS-PAGE
• 2.2.9 溶栓酶功能试验
• 2.2.9.1 体外抗凝血试验
• 2.2.9.2 溶栓试验
• 3 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌溶栓酶的分离与纯化
• 3.1.1 枯草芽孢杆菌溶栓酶的纯化
• 3.1.2 溶栓酶活力的标准曲线
• 3.1.3 溶栓酶蛋白质浓度的标准曲线
• 3.1.4 SEPHADEX-G100柱层析分离纯化溶栓酶
• 3.2 溶栓酶的理化性质
• 3.2.1 最适温度
• 3.2.2 热稳定性
• 3.2.3 最适PH
• 3.2.4 PH稳定性
• 3.2.5 金属离子的影响
• 3.2.6 有机溶剂影响
• 3.2.6.1 甲醇对溶栓酶的影响
• 3.2.6.2 乙醇对溶栓酶的影响
• 3.2.6.3 异丙醇对溶栓酶的影响
• 3.3 溶栓酶基因的克隆和表达
• 3.3.1 PCR扩增溶栓酶基因的结果
• 3.3.2 PMD18-T-DFE载体的构建
• 3.3.3 序列测定和同源性比对
• 3.3.3.1 序列测定
• 3.3.3.2 同源性比对
• 3.3.4 PET32A-DFE表达载体的构建
• 3.3.5 目的蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.4 溶栓酶功能测定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢