双孔介质在高速色谱分离中的应用

论文题目: 双孔介质在高速色谱分离中的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化工

作者: 李渊

导师: 孙彦

关键词: 液相色谱固定相,流通色谱,快速分离,双孔型树脂,手性固定相,质粒,纯化,基因治疗载体

文献来源: 天津大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本文主要研究了双孔型色谱介质在手性拆分和质粒纯化中的应用。首先以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,双甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,采用固液联合致孔方式,通过一步悬浮聚合制备了球形树脂,利用扫描电镜和压汞仪对树脂的外貌和内部孔结构进行了表征,结果表明此树脂具有双孔型结构。以双孔型树脂为载体,以三聚氯氰为间隔臂,以牛血清白蛋白为手性配基制备了蛋白质手性色谱固定相。以d, l-色氨酸为探针,考察了pH值、流速和上样量等因素对分离性能的影响,结果表明上述因素对分离度的影响较小。当上样量为0.1 mg,流速为1800 cm/h时,色氨酸的分离度仍可达到1。比较了色氨酸在双孔型色谱介质上的分离度和在普通色谱固定相上分离度随流速的变化关系,结果表明在双孔型介质上的分离度受流速变化的影响较小。在质粒的提取过程中考察了硫酸铵和氯化钙对质粒收率及对蛋白质和RNA去除效果的影响。实验发现硫酸铵是去除蛋白质和RNA的有效试剂,同时能够保持较高的质粒收率,当质粒提取液中硫酸铵的浓度达到2.5 M时,质粒的纯化因子可达10.2,而质粒的收率在90%以上,氯化钙的加入也能有效去除质粒提取液中蛋白质和RNA,但是质粒的收率相对较低。以苯酚为配基,对双孔型树脂进行修饰,制备了疏水性色谱固定相,用于质粒的纯化,优化了色谱分离条件。由于双孔型树脂中大孔的存在,提高了介质内部的传质速率,增大了对生物大分子的吸附表面,使得双孔型介质可以在高流速下进行质粒的纯化,同时保持较高的分离度。当流速为20cm/min,上样量为8 mL (质粒浓度为0.32 mg/mL)时,质粒的收率和质粒产品的纯度均可到达100%。以2-巯基吡啶为配基对双孔型介质进行修饰,制得色谱固定相,并以此固定相进行质粒的纯化。考察了离子强度、pH值和配基修饰等因素对质粒分离效果的影响,从实验结果推测此介质对质粒纯化的机理基于疏水作用。当流速为20 cm/min,上样量为10 mL (质粒浓度为0.30 mg/mL)时,质粒的收率和质粒产品的纯度均可到达100%。

论文目录:

第一章文献综述

1.1 前言

1.2 液相色谱固定相的研究进展

1.2.1 传统色谱介质

1.2.1.1 无机基质固定相

1.2.1.2 有机高分子固定相

1.2.2 流通色谱介质

1.3 液相色谱手性固定相的研究进展

1.3.1 “刷型”手性色谱固定相

1.3.1.1 第一代“刷型”固定相

1.3.1.2 第二代 Pirkle CSP

1.3.1.3 第三代 Pirkle CSP

1.3.1.4 Pirkle CSP 的拆分机理

1.3.2 蛋白质类手性色谱固定相

1.3.3 大环类手性色谱固定相

1.3.3.1 β-环糊精类色谱固定相

1.3.3.2 其它大环类手性色谱固定相

1.3.4 纤维素及其衍生物类手性色谱固定相

1.3.5 配体交换(LEC)手性色谱固定相

1.3.6 人工合成的聚合物手性色谱固定相

1.4 质粒DNA 及核酸疫苗分离纯化的研究进展

1.4.1 质粒的大规模分离纯化过程

1.4.2 细胞裂解和质粒提取液的制备

1.4.3 质粒提取液的净化和浓缩

1.4.4 质粒的色谱纯化

1.4.4.1 离子交换色谱

1.4.4.2 体积排阻色谱

1.4.4.3 疏水性作用色谱

1.4.4.4 反相色谱

1.4.4.5 亲和色谱

1.5 本文的主要内容

第二章蛋白质手性色谱固定相的合成及其性能

2.1 前言

2.2 实验器材与方法

2.2.1 实验试剂及器材

2.2.2 蛋白质手性色谱固定相的合成

2.2.2.1 双孔微球的制备

2.2.2.2 致孔剂的脱除

2.2.2.3 用蛋白质对基质进行修饰

2.2.3 双孔球形分离介质的结构表征

2.2.3.1 粒径分布分析

2.2.3.2 微观结构分析

2.2.3.3 孔径分布分析

2.2.3.4 含水量的测定

2.2.3.5 湿密度的测定

2.2.4 色谱实验

2.2.4.1 流动性能

2.2.4.2 手性分离

2.3 结果与讨论

2.3.1 介质的孔结构和物理性能

2.3.2 介质的流动性能

2.3.3 蛋白质手性柱对色氨酸的分离

2.4 结论

第三章硫酸铵和氯化钙对质粒提取的影响

3.1 前言

3.2 实验器材与方法

3.2.1 实验试剂及器材

3.2.2 菌种与质粒

3.2.3 质粒菌的培养

3.2.4 质粒纯品的制备

3.2.5 质粒粗品的制备

3.2.6 用硫酸铵沉淀质粒提取液中的蛋白质和 RNA

3.2.7 用氯化钙沉淀质粒裂解液中的蛋白质和 RNA

3.2.8 分析方法

3.2.8.1 核酸的定量分析

3.2.8.2 质粒产品中蛋白质含量的测定

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 质粒浓度的测定

3.3.2 硫酸铵对质粒提取的影响

3.3.3 氯化钙对质粒提取的影响

3.4 结论

第四章双孔型疏水性介质的制备及其对质粒的纯化

4.1 前言

4.2 实验器材与方法

4.2.1 实验试剂及器材

4.2.2 菌种与质粒

4.2.3 双孔球形分离介质的结构表征

4.2.4 疏水色谱固定相的制备

4.2.4.1 基质的制备

4.2.4.2 基质的修饰

4.2.5 质粒菌的培养及质粒提取液的制备

4.2.6 质粒纯品的制备

4.2.7 色谱实验

4.2.8 分析方法

4.2.8.1 核酸的定性、定量分析

4.2.8.2 质粒样品中蛋白质含量的测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 介质的物理特性及流体力学特性

4.3.2 疏水性色谱介质对质粒的纯化

4.3.2.1 硫酸铵的浓度对分离效果的影响

4.3.2.2 高流速下对质粒进行纯化

4.4 结论

第五章以巯基吡啶为配基的固定相的制备及对质粒的纯化

5.1 前言

5.2 实验器材与方法

5.2.1 实验试剂及器材

5.2.2 菌种及质粒

5.2.3 介质的制备

5.2.3.1 基质的制备

5.2.3.2 基质的修饰

5.2.3.3 介质的配基修饰密度

5.2.4 双孔球形分离介质的结构表征

5.2.5 质粒菌的培养及质粒提取液的制备

5.2.6 质粒纯品的制备

5.2.7 色谱实验

5.2.8 分析方法

5.2.8.1 核酸的定性与定量分析

5.2.8.2 质粒产品中蛋白质含量的测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 介质的物理特性

5.3.2 以巯基吡啶为配基的双孔型介质对质粒的纯化

5.3.2.1 硫酸铵对质粒、RNA 和蛋白质吸附性能的影响

5.3.2.2 巯基吡啶的修饰对基质分离性能的影响

5.3.2.3 分离机理的探讨

5.3.2.4 高流速下对质粒的分离

5.4 结论

第六章结论与展望

6.1 结论

6.2 对今后工作的建议与展望

参考文献

博士期间发表的论文和参加的科研项目

附录

附录 1 BSA 标准曲线的绘制

附录 2 质粒DNA 标准曲线的绘制

附录 3 BRADFORD 法测定蛋白质浓度标准曲线的绘制

附录 4 几种缓冲液的配制

致谢

发布时间: 2006-05-24

参考文献

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