基于大豆酯酶的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法研究

论文摘要

本文以酶检测法为出发点，寻找良好的植物酶源替代动物乙酰胆碱酯酶，系统研究了大豆植物酯酶的提取、分离和纯化，并进行了较为系统的酶学特性表征，研究和建立了多种形式的大豆酯酶农药残留快速检测方法和体系。主要研究结果如下：1．大豆酯酶水提取的最佳条件为：大豆种子粉碎，料液比1：5，振荡或搅拌处理30min左右，4℃冰箱静置过夜，过滤离心即得大豆酯酶粗酶液；大豆酯酶的磷酸盐缓冲液抽提和分离纯化条件为：大豆种子经拣选、粉碎，以1：5料液比加0.3moL／LpH 7.0PBS抽提，震荡或搅拌处理30min，4℃冰箱静置浸提过夜，纱布过滤，差速离心（6000rpm-1000rpm），60％硫酸铵盐析沉淀，透析，超滤浓缩得粗酶液，经DEAE-32离子交换层析，收集酶活性峰即得大豆酯酶纯酶制品，再经浓缩得浓缩酶液，或冷冻干燥得大豆酯酶冻干粉，-20℃低温冷冻保存。所得酶活力为62.48 U／mL，比活力为6.455 U／mg．pro．经各步纯化及浓缩后，对酶的提纯倍数可达90.92倍，酶的回收率为6.32％。2．研究了大豆酯酶的酶学特性：大豆酯酶的Km值为2.97μmoL／L；酶促反应的适宜温度为25℃-40℃，最适温度为30℃，酶促反应的适宜pH值范围为7.0-8.0，最适pH值为7.5；在50℃-60℃下1h后，活力降低50％左右，12h后，活力降低1／4；酸性环境下（pH≤6）酶易失活；缓冲液离子强度在0.2moL／L-0.3moL／L的体系中酯酶活力较大，最适缓冲液离子强度为2.5moL／L。大豆酯酶适宜在-20℃以下保存，-20℃保存2个月、4个月、6个月时，酶相对活力分别为87.4％、64.8％和42.6％。大豆酯酶由两种分子量不同的亚基组成，其分子量分别为44.67KD和69.18KD；对大豆酯酶酶促反应体系的显色稳定性研究表明，以a-乙酸萘酯为底物，固兰B盐为显色剂，10min内显色液较为稳定，酶的活性测定应在10min内完成。3．建立了基于大豆酯酶的酶抑制-光度法农药残留快速检测方法。结果表明，大豆酯酶对除倍硫磷外的其他24种有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的敏感性均较好，最低检测限（LOD）都远远低于其MRL值，对18种有机磷农药的LOD在0.03125mg．kg-1-0.0625 mg·kg-1范围之间，其中，对毒死蜱、乐果和杀扑磷的LOD甚至达到了其MRL的1／32；对6种氨基甲酸酯类农药的LOD值为0.03125 mg·kg-1-0.25 mg·kg-1。完全可以满足除倍硫磷以外的其他24种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测要求。对于苹果样品中5种有机磷类农药加标回收率在78.5％-102.1％，变异系数在3.1％-5.1％范围内，对3种氨基甲酸酯类农药加标回收率为87.4％-94.0％，变异系数在2.3％-3.8％范围内，与GC检测结果的符合率达100％。4．建立了基于大豆酯酶的酶抑制-电位法农药残留快速检测方法。用所建立的方法检测了水样中20种有机磷及8种氨基甲酸酯类农药的敏感性和最低检测限，结果表明，对有机磷农药的LOD可达0.000625 mg·kg-1-0.0625 mg·kg-1，对氨基甲酸酯类农药的LOD为0.015 mg·kg-1-0.3125 mg·kg-1。经与国家规定的最大残留限量（MRL）相比较，除倍硫磷之外的27种农药的最低检测限均可达到MRL限值要求。27种农药在苹果样品中的回收率在82.5％-92.3％之间，变异系数在2.03％-5.22％之间。对果蔬样品的检测与GC检测结果的符合率达83％以上。5．获得了硝酸纤维（NC）膜固定化大豆酯酶的制备技术路线和工艺参数，进行了固定化酶特性和固定化效率研究，并测试了酶片检测性能。经60个批次的固定化酶片试验，各批次之间标准差为0.031，变异系数为4.36％，说明该固定化方法的重现性和精密度良好；所制备的NC膜固定化大豆酯酶片，酶活回收率为15.37％；经7次重复使用后仍有60％以上的活性，表明固定化酶反复使用的工作稳定性较好；固定化酶最适pH为8.0，比游离酶提高了0.5个pH单位，最适温度为35℃，比游离酶提高了5℃；固定化酶的保存稳定性比游离酶明显提高。对所制备的NC-大豆酯酶膜进行了超微结构和红外光谱表征及固定化机理探讨。扫描电镜观察表明，使用戊二醛交联剂可使大豆酯酶有效地固定化于NC膜，与单纯的NC膜上承载大豆酯酶比较，酶在膜上的分布较多且较均匀；对NC膜固定化大豆酯酶前后的红外谱图解析表明，NC膜上的氨基经戊二醛连接臂与酶分子中的氨基酸残基上的游离基团产生了共价交联而实现了酶在膜上的固定化；固定化前对NC膜的PBS浸泡处理可使膜表面孔径明显增大，膜表面游离基团充分暴露，有利于酶的固定化。建立了NC-大豆酯酶膜农药残留快速检测方法，并进行了对农药残留检测效果试验。用本研究所制备的大豆酯酶NC膜片，采用目测法对水样中29种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的最低检测限在0.4 mg·kg-1-5 mg·kg-1之间；比色法对水样中8种农药检测限为0.00625 mg·kg-1-0.0625 mg·kg-1，远远低于其MRL值，相关系数为0.9584-0.9932；对苹果样品中8种农药的回收率在85.3％-91.8％之间，变异系数均小于5.21％，表明本方法具有较好的准确度和精密度。6．探索性研究了魔芋葡苷聚糖（KGM）膜固定化大豆酯酶方法，对所制备的KGM-大豆酯酶膜进行了超微结构和红外光谱表征及固定化机理探讨，并测试了KGM酶膜性能。KGM大豆酯酶膜制备的主要参数为，1％的KGM溶胶用Na2CO3调整pH为8进行改性，添加1％的甘油作增塑剂，再加入大豆酯酶，制膜。所制备的KGM大豆酯酶膜有良好的感官性能，如超薄、透明、柔韧、可塑性强等；对所制备的KGM-大豆酯酶膜性能试验表明，酶活回收率可达50％以上，与同一批游离酶活性测定表明，固定化酶比游离酶活性几乎没有损失，表明大豆酯酶在KGM膜中可高活性表达。环境扫描电镜观察表明，大豆酯酶被完整包埋于KGM膜中，并且在膜中有较均匀的分布；对KGM膜固定化大豆酯酶前后的红外谱图解析表明，酶分子中的氨基酸残基与KGM膜中的羰基以氢键方式或共轭效应方式结合，这种固定化方式较为温和，有利于维持酶的活力。由于KGM酶膜的上述良好特性，以及酶在膜中的高活性表达，有望成为生物传感器法检测农药残留的新型膜材料，同时，也可作为其他酶传感器膜材料制备的方法学参考。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 表格索引
• 图形索引
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 农药的使用及其在食品中的残留
• 1.1.1 农药的发明和发展历程
• 1.1.2 农药在农业生产中的地位和作用
• 1.1.3 农药的生产与使用概况
• 1.1.4 农药使用所带来的负面作用
• 1.1.5 农药在食品中的残留现状
• 1.1.6 化学农药的使用趋势及我们的任务
• 1.2 农药残留分析方法研究
• 1.2.1 仪器分析方法
• 1.2.2 快速检测方法
• 1.3 快速检测酶源研究进展
• 1.3.1 酯酶及其同功酶
• 1.3.3 植物酶源
• 1.4 农残检测酯酶的固定化研究进展
• 1.4.1 酶的固定化方法
• 1.4.2 农药残留检测酯酶的固定化研究现状
• 1.4.3 固定化酯酶的农残检测研究
• 1.5 研究动态和技术需求分析与展望
• 1.5.1 国内外农药残留快速检测动态
• 1.5.2 技术需求分析与展望
• 1.6 本项目选题背景及研究内容和目标
• 1.6.1 选题背景
• 1.6.2 研究内容
• 1.6.3 研究目标
• 第二章 大豆酯酶的提取纯化研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 大豆酯酶的水提条件研究
• 2.2.2 大豆酯酶的分离与纯化
• 2.3 本章小结
• 第三章 大豆酯酶的酶学特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 主要化学试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 试验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 大豆酯酶的组成及分子量
• 3.2.2 大豆酯酶酶学特性研究
• 3.3 本章小结
• 第四章 基于大豆酯酶的农药残留快速检测体系研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 主要化学试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 试验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 酶抑制光度法快速检测体系的建立与评价
• 4.2.2 酶抑制电位法快速检测体系的建立与评价
• 4.2.3 前处理方法试验结果
• 4.2.4 两种快速检测体系与气相色谱检测方法的符合率
• 4.3 本章小结
• 第五章 大豆酯酶酶膜制备及其农药残留快速检测方法研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 主要化学试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 试验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 NC膜固定化大豆酯酶的条件优化
• 5.2.2 NC膜固定化大豆酯酶的重现性
• 5.2.3 固定化酶膜的工作稳定性
• 5.2.4 NC膜固定化酶特性的变化
• 5.2.5 NC酶膜上的电镜及红外光谱表征
• 5.2.6 固定化酶膜保存特性研究
• 5.2.7 固定化酶膜对农药残留检测方法的建立
• 5.2.8 固定化酶膜实际样品检测方法的确立
• 5.2.9 固定化酶膜测定法与气相色谱法的比较
• 5.2.10 KGM膜改性试验结果
• 5.2.11 KGM酶膜的电镜和红外光谱表征
• 5.3 本章小结
• 全文结论
• 参考文献
• 创新摘要
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文及研究成果