脐带间充质干细胞的分离、鉴定和培养条件的优化

论文摘要

目的：1.从脐带中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,并研究其形态、分子表型和分化能力等基础特征。2.研究低氧环境、青霉素和链霉素及血小板衍生生长因子（PDGF）带间充质干细胞（UC-MSC）增殖、凋亡和胞外基质（ECM）成分基因表达的影响,寻找最适培养条件,并探讨其可能的作用机制。方法：1.用酶消化法从脐带中分离出单个细胞,贴壁法进行培养、纯化；显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线；流式细胞仪检测其表面标志；分别用成骨、成软骨和成脂肪诱导剂予以诱导,并通过碱性磷酸酶（ALP）染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色进行分化能力鉴定。2.取稳定增殖的UC-MSC,分为实验组和对照组,分别置于低氧和常氧条件下培养,分别在24h、48h以MTT法检测两组UC-MSC增殖情况,2d后流式细胞仪检测两组UC-MSC表面抗原表达情况,24h后实时定量聚合酶链反应（real-time Q-PCR）法检测两组UC-MSC中ECM和凋亡相关基因（bcl-2,bax）的cDNA表达情况。3.将脐带间充质干细胞分为对照组、青霉素组和链霉素组培养,其中对照组不加抗生素,青霉素组与链霉素组各分为100、500和1000 U/mL三个浓度组,培养24h后以MTT法检测各组UC-MSC增殖情况,培养12h后以real-time Q-PCR法检测各组UC-MSC中ECM和bcl-2、bax的cDNA表达情况。4.将脐带间充质干细胞分为对照组和实验组,其中对照组不加PDGF,实验组分别加入不同浓度（2、5、10、20、50ng/mL）的PDGF,加入PDGF24h后,以MTT法检测各组UC-MSC增殖情况,加入PDGF12h后,以real-time Q-PCR法检测各组UC-MSC中ECM和bc1-2、bax的cDNA表达情况。结果：1.从人脐带中分离出的贴壁细胞主要表现为长梭形的成纤维样细胞,呈平行排列生长或漩涡状生长；细胞表面标志物CD105, CD90、CD73、CD166和CD44阳性表达,CD29阳性表达率为47.45%,CD34、CD45和CD31阴性表达；在外来诱导剂的诱导下,脐带中分离得到的细胞可向成骨、软骨和脂肪细胞分化。2.培养条件优化实验中,低氧组UC-MSC的OD值及克隆形成率明显高于常氧组；两组UC-MSC表面抗原的表达总体无明显差异,低氧组CD105阳性表达率略高于常氧组；低氧组UC-MSC中ECM成分的表达较常氧组有所增加；bcl-2与bax在低氧条件下表达均上调,但bcl-2的上调程度较bax更明显。3.低浓度的青霉素和链霉素作用下,UC-MSC的OD值明显升高,浓度为100U/mL时OD值最高；同时青链霉素能降低其ECM成分的表达,且抗生素浓度越高,ECM表达降低越多；低浓度的青链霉素能提高bcl-2/bax的cDNA表达比值。4.随着PDGF浓度的增加,细胞OD值逐渐增加,且PDGF在20ng/mL浓度时达到最高值,但PDGF浓度为50ng/mL时OD值反而降低；PDGF为2ng/mL时,ECM成分表达和bcl-2/bax比值较对照组有所降低,随着PDGF浓度的增加,ECM的表达和bcl-2/bax比值呈现先增高后降低的趋势,且在10ng/mL时达到最高值。结论：1.从脐带中成功分离培养的细胞,具有MSCs生物学特性。2.在UC-MSC的体外培养中,低氧环境能够促进UC-MSC的增殖并增加ECM成分的表达,使细胞耐受凋亡。3.低浓度的青链霉素可促进UC-MSC增殖,降低凋亡比率,但大剂量使用会降低UC-MSC中ECM成分的表达。4. PDGF可以促进UC-MSC的增殖,同时能促进其ECM的表达,还能提高细胞耐受凋亡的能力,最佳作用浓度为10 ng/mL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 脐带间充质干细胞培养条件的优化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表