论文摘要
研究背景和目的衰老是机体随年龄改变而发生的所有现象的集中体现。在衰老过程中,机体各组织器官的功能逐渐降低,最终导致机体死亡。因此,可以把衰老定义为机体对内、外环境改变的、年龄依赖性的易损性增加。大量的研究表明,衰老是导致冠心病的主要独立危险因子。衰老的心脏心功能下降、对缺血/再灌注损伤敏感性高、梗死面积大、溶栓治疗和预后处理对老年心梗病人的收效也远不如对青年人,提示老年心脏对心肌缺血等疾病易感性增加,但其机制一直处于探索之中。近年的研究表明,人类和动物衰老过程中出现大量心肌细胞丢失;从17岁到90岁,单纯由于年龄因素,人体心肌细胞减少约1/3;在70岁健康男性中,仅由衰老导致的心肌细胞丢失就占左、右心室细胞总数的30%。由于心肌细胞是心脏功能活动的基本单位,这种随年龄增长发生的心肌细胞进行性丢失可能是衰老心脏心功能下降和对疾病易感性增加的重要因素。目前,全球人口老龄化趋势增高,心血管疾病的发病率和死亡率都将继续增长。因此,努力揭示与年龄相关的心肌细胞死亡机制,进而寻求更有效的防治措施是当今亟待解决的重大科学问题。组织器官中细胞丢失的主要原因为细胞死亡,后者又主要分为细胞坏死和细胞凋亡。研究发现在衰老小鼠心脏,心肌细胞坏死和细胞凋亡均有出现,但随着年龄增加,左心室心肌细胞的凋亡率逐渐上升,而坏死的发生率却没有改变,提示细胞凋亡在衰老心脏心肌细胞死亡过程中起主要作用。由于凋亡是一种基因控制的主动过程,所以抑制凋亡的发生可能比阻止坏死更容易做到。生理情况下,凋亡受多种促凋亡分子和抑凋亡分子之间平衡的调控,而这些分子又由上游调节分子之间的平衡进行调控。由于凋亡信号转导的复杂性,使得某种特殊类型细胞（如心肌细胞）在某些特殊应激情况下（如衰老和缺血/再灌注）,不可能激活所有的促凋亡分子和破坏每一种促/抑凋亡分子之间的平衡,因此特异性寻找衰老心脏中激活的促凋亡分子和被破坏的促/抑凋亡分子平衡,并揭示其中细胞凋亡调节失衡机制,将成为解决衰老、心脏功能异常及缺血性心脏病中非常有意义的一步。X染色体连锁的凋亡抑制蛋白（X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein,XIAP）,是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白,是哺乳动物体内唯一的内源性线粒体后凋亡抑制蛋白,它通过与促凋亡蛋白Caspase-9或Caspase-3结合来抑制后者的作用。研究发现线粒体可以释放两种促凋亡蛋白Smac/DIABLO和HtrA2/Omi,它们均能特异性识别并结合XIAP,使XIAP无法与Caspases结合,从而降低XIAP的抑凋亡作用。与细胞色素c、凋亡诱导因子（ApoptoticInducing Factor,AIF）和Smac/DIABLO等其它线粒体促凋亡蛋白质相比,HtrA2/Omi分子结构中还存在有丝氨酸蛋白酶结构域,可以通过其丝氨酸蛋白酶活性直接降解XIAP,发挥促凋亡作用。研究表明,过表达HtrA2/Omi的心肌细胞中凋亡显著增加。此外,用RNA干扰技术沉默HtrA2/Omi的细胞对于紫外线诱导的细胞凋亡敏感性下降。大量临床和基础研究提示,衰老心脏心肌细胞凋亡增加,有可能导致随年龄而增加的心肌细胞丢失,进而导致心功能下降,但其机制一直处于探索之中。此外,衰老的心脏对伤害性刺激（如心肌缺血/再灌注损伤）的易感性增加的确切机制也尚不明了。XIAP作为一种哺乳动物唯一的内源性线粒体后凋亡抑制蛋白,是否与这些机制有关还不清楚?如果有关,哪些内源性促凋亡蛋白可能参与了对XIAP的影响:是Smac/DIABLO还是HtrA2/Omi,或二者皆有?这种影响是否能解释衰老心肌细胞的丢失增加、衰老心肌功能障碍?而且,这种改变是否与衰老心肌缺血/再灌注损伤易感性增加有关呢?基于这些问题,我们做了以下相关研究。一、衰老对心脏中HtrA2/Omi表达影响及与心肌细胞凋亡的关系目的1、验证衰老心脏心功能改变以及心肌细胞凋亡程度;2、观察衰老心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi及Smac/DIABLO内源性线粒体后凋亡调节蛋白的表达,及其与心肌细胞凋亡的关系。方法（1）分别选取雄性成年SD大鼠（4-6月,n=39）（其中测定心功能死2只,呼吸道感染1只）和老年SD大鼠（22-24月,n=63）（其中测定心功能死7只,排除患肿瘤2只,呼吸道感染6只）,随机分为以下4组:①正常成年组（n=36）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉;②正常老年组（n=36）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉:③老年ucf-101组（n=6）:腹腔注射ucf-101（1.5μmol/kg）3小时后,经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉;④老年DMSO组（n=6）:腹腔注射DMSO（1.5μmol/kg）3小时后,经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉。（2）经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数（Cardiac Index,CI）等心功能指标;（3）分别采用原位末端标记法（TUNEL）和Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况;（4）用Western-blot法检测大鼠心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi、Smac/DIABLO蛋白水平的表达水平;（5）用Real-Time PCR法检测大鼠心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi、Smac/DIABLO基因水平的表达水平。结果1.衰老大鼠心功能明显降低1.1心肌收缩功能的指标与成年大鼠的显示收缩能力的心功能指标(CI:46.82±3.176 s-1)相比,衰老大鼠的相应指标(CI:39.23±1.62 s-1,P＜0.05)明显下降（图1、2）。1.2心肌舒张功能的指标与成年大鼠的显示舒张能力的心功能指标（LVDP:-1.16+0.35kPa,LVEDP:-0.70±0.43 kPa）相比,衰老大鼠的相应各项心功能指标（LVDP:0.16±0.17kPa,P＜0.01;LVEDP:1.25±0.35kPa,P＜0.01）明显增高（图3、4）。以上结果验证了,衰老大鼠的心肌收缩及舒张功能均明显低于成年大鼠。2.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加2.1 TUNEL染色结果TUNEL染色是检测细胞凋亡的一种较灵敏的方法,通过该方法分别对成年大鼠及衰老大鼠心肌组织进行检测、并计数凋亡指数。结果显示,成年大鼠心肌细胞凋亡率为（0.86%±0.29%）,衰老大鼠为（2.86%±0.43%）,二者相比,衰老大鼠心肌细胞凋亡明显增加（P＜0.05,图5、6）。2.2 Caspase-3活性测定结果由于TUNEL染色方法的特异性较低,我们又测定了细胞凋亡最后通路的关键蛋白Caspase-3的活性,后者可以定量反映细胞凋亡发生情况。以成年大鼠Caspase-3比活性（1.00±0.028）为1进行比较,结果发现衰老大鼠的Caspase-3的比活性（2.21±0.327,P＜0.01）显著增高（图7）。以上结果提示,老年大鼠心肌细胞凋亡明显增加。3.衰老大鼠心肌组织XIAP表达降低,HtrA2/Omi表达增高,Smac/DIABLO表达无显著差异3.1衰老大鼠心肌组织XIAP表达降低用Western-blot检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中XIAP蛋白表达水平。与成年大鼠的XIAP相比,衰老大鼠的心肌组织的XIAP水平显著降低（P＜0.05,图8）;为进一步观察其转录水平情况,用Real-Time PCR检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中XIAP基因表达水平。与成年大鼠的XIAP相比,衰老大鼠的心肌组织的XIAPmRNA水平显著降低（P＜0.01,图9、10）。3.2衰老大鼠心肌组织Smac/DIABLO表达无显著性差异用Western-blot检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中Smac/DIABLO蛋白表达水平。衰老大鼠与成年大鼠的Smac/DIABLO蛋白表达水平无显著性差异（P＞0.05,图11）;为进一步观察其转录水平情况,用Real-Time PCR检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中Smac/DIABLO mRNA表达水平,结果表明二者之间无显著性差异（P＞0.05,图12、13）。3.3衰老大鼠心肌组织HtrA2/Omi表达增高HtrA2/Omi和Smac/DIABLO是可以与XIAP特异结合的两种蛋白质。用Western-blot检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中HtrA2/Omi蛋白表达水平。与成年大鼠的HtrA2/Omi相比,衰老大鼠的心肌组织的HtrA2/Omi显著升高（P＜0.05,图14）:为进一步观察其转录水平情况,用Real-Time PCR检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中HtrA2/Omi基因表达水平。与成年大鼠的HtrA2/Omi相比,衰老大鼠的心肌组织的HtrA2/Omi mRNA水平显著升高（P＜0.05,图15、16）。以上结果提示,正常衰老大鼠心肌XIAP表达明显下降可能与HtrA2/Omi的表达增加有关,但需要进一步证实。4.给予HtrA2/Omi特异性抑制剂ucf-101,减少心肌细胞的凋亡由以上的结果我们发现,HtrA2/Omi表达的升高可能是衰老大鼠心肌XIAP表达下调的原因。因此我们选用HtrA2/Omi酶活性的特异性抑制剂ucf-101,观察凋亡的情况和XIAP以及HtrA2/Omi蛋白表达情况。分别对随机分配的两组衰老大鼠腹腔注射ucf-101（1.5μmol/kg）以及DMSO（1.5μmol/kg）,以心肌组织Caspase-3的活性表示心肌细胞凋亡的程度。结果表明,与腹腔注射DMSO的衰老大鼠相比,腹腔注射ucf-101的衰老大鼠的心肌组织Caspase-3活性显著降低（P＜0.05,图17）。但是XIAP与HtrA2/Omi蛋白含量却没有显著变化。以上结果反证了,HtrA2/Omi表达的升高可能是正常衰老大鼠心肌凋亡发生的原因,但由于ucf-101是HtrA2/Omi酶活性的抑制剂,对XIAP和HtrA2/Omi的含量并没有显著变化。小结1.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加、心功能明显降低;2.衰老大鼠心肌组织中HtrA2/Omi表达明显增高,XIAP表达明显下降,Smac/DIABLO表达不变。提示在衰老大鼠心肌组织中表达增多的HtrA2/Omi,可能导致了XIAP的降解以及随后的Caspases活化和细胞凋亡;3.在衰老大鼠中,给予特异性HtrA2/Omi的抑制剂可显著减少心肌细胞凋亡,提示HtrA2/Omi在衰老心肌细胞凋亡中可能具有比较重要的作用。由于HtrA2/Omi是目前认为较强的线粒体后促凋亡蛋白,因此特异性抑制HtrA2/Omi表达或阻断其从线粒体的释放,可能成为抑制衰老心脏细胞凋亡的新靶点。二、衰老心肌缺血/再灌注易感性增高可能与HtrA2/Omi的高表达有关目的1、验证衰老心脏对缺血/再灌注损伤的易感性增加;2、观察衰老心脏缺血/再灌注后心肌细胞中HtrA2/Omi是否由线粒体释放入胞浆,并探讨衰老的心脏与缺血/再灌注损伤易感性增加的机制。方法（1）分别选取雄性成年SD大鼠（4-6月,n=38）（其中测定心功能死3只,呼吸道感染5只）和老年SD大鼠（22-24月,n=54）（其中测定心功能死4只,自发性肿瘤1只,呼吸道感染7只）,随机分为6组:①成年伪手术组（成年Sham组n=6）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉:②老年伪手术组（老年Sham组n=6）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉;③成年缺血/再灌注组（成年MI/R组n=24）:左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时;④老年缺血/再灌注组（老年MI/R组n=24）:左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时;⑤老年缺血/再灌注+ucf-101组（老年MI/R+ucf-101组n=6）:左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时,再灌注前10分钟腹腔注射ucf-101（1.5μmol/kg）;⑥老年缺血/再灌注+Vehicle组（老年MI/R+DMSO组n=6）:左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时,再灌注前10分钟腹腔注射DMSO（1.5μmol/kg）。（2）六组实验动物分别经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数（Cardiac Index,CI）等心功能指标;（3）分别采用原位末端标记法（TUNEL）和Caspase-3活性测定法测定心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况;（4）采用Evanse blue和TTC复染法检测心肌缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面积;（5）分别提取心肌组织中线粒体及胞浆成分,用Western-blot法检测其中HtrA2/Omi、XIAP蛋白水平的表达。结果1.衰老大鼠心肌对缺血再灌注损伤易感性增加1.1衰老大鼠心肌缺血再灌注后心功能明显降低1.1.1心肌收缩功能的指标与成年大鼠缺血再灌注组(CI:50.034±3.176 s-1)比较,心肌缺血再灌注时老年大鼠的CI明显下降(CI:41.68±1.62 s-1 P＜0.05,图20),+dp/dtmax明显下降（P＜0.01,图21）。1.1.2心肌舒张功能的指标与成年缺血再灌注组显示舒张能力的心功能指标:LVDP、LVEDP、-dp/dtmax（LVDP:14.68±0.17kPa;LVEDP:0.9±0.35kPa,P＜0.05）相比,衰老缺血再灌注组的大鼠的相应各项心功能指标LVDP升高（图22）;LVEDP升高明显增高（LVDP:12.84±0.35kPa,LVEDP:-0.36±0.43 kPa,P＜0.01）（图23）;-dp/dtmax下降（P＜0.05,图24）。1.2衰老大鼠心肌缺血再灌注后心梗面积增加经测定,心肌缺血再灌注后各组大鼠危险区面积与左心室面积比值基本一致,说明各组具有可比性,排除了由于手法原因而造成的结果误差。实验结果显示,与成年大鼠心梗面积比较,衰老大鼠心梗面积较成年大鼠增大（P＜0.05,图25、26）。1.3衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡增加1.3.1 TUNEL染色结果成年大鼠心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡率为（14.6%±1.7%）,衰老大鼠心肌缺血再灌注后,达到（19.0%±2.1%）,二者相比,衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡增加（P＜0.05,图27、28）1.3.2 Caspase-3活性测定结果与成年大鼠心肌缺血再灌注后的Caspase-3比活性（340±32μmol pNA/mg）相比,衰老大鼠心肌缺血再灌注后的Caspase-3的比活性（436±35μmol pNA/mg）显著增高（P＜0.05,图29）。以上结果验证了,衰老大鼠心肌缺血再灌注后心功能明显下降,凋亡显著增加,那么是否与抑调亡蛋白XIAP和促调亡蛋白HtrA2/Omi有关,遂进行下面实验。2.心肌细胞中HtrA2/Omi释放增加、XIAP表达减少与衰老大鼠心肌缺血再灌注损伤易感性增加有关2.1衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞中XIAP表达减少用Western-blot检测衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞中XIAP蛋白表达水平。与成年大鼠XIAP相比,衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞中XIAP的蛋白水平显著降低（P＜0.05,图30）。2.2衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi表达增加由第一部分结果发现,在衰老的大鼠心肌中HtrA2/Omi能显著降低XIAP的表达。研究发现,细胞接受内外源性刺激后,HtrA2/Omi从线粒体释放入胞浆显著增加。因此用Western-blot检测衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi蛋白表达水平。与成年大鼠相比,衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌组织胞浆中HtrA2/Omi水平显著升高（P＜0.05,图31）以上结果提示,衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞胞浆的HtrA2/Omi表达增加可能与XIAP的表达下降有关,但需要进一步证实。3.给予ucf-101使衰老大鼠心肌缺血再灌注后HtrA2/Omi的释放减少、XIAP表达增加3.1给予ucf-101后老年心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi表达减少由以上的结果发现,HtrA2/Omi表达的升高可能与老年大鼠心肌缺血再灌注后XIAP表达下调有关。因此再次选用HtrA2/Omi酶活性的特异性拮抗剂ucf-101,观察用药后大鼠心肌的凋亡情况以及XIAP和HtrA2/Omi的蛋白表达情况。用Western-blot检测衰老大鼠心肌再灌注前10分钟给予ucf-101组与给予Vehicle组的心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi蛋白表达水平。与给予Vehicle组的心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi相比,给予ucf-101组的心肌细胞胞浆中HtrA2/Omi减少（P＜0.05,图31）。3.2给予ucf-101后老年缺血再灌注大鼠心肌细胞胞浆中XIAP降解减少、XIAP表达增加用Western-blot检测衰老大鼠心肌再灌注前给予ucf-101组与给予Vehicle组的心肌细胞胞浆中XIAP蛋白表达水平。与给予Vehicle组的心肌细胞胞浆中XIAP相比,给予ucf-101组的心肌细胞胞浆中XIAP的表达增高（P＜0.05,图30）。以上结果反证了,HtrA2/Omi可能是造成老年缺血再灌注心肌细胞胞浆XIAP表达下降的主要原因之一。随后我们将进一步观察抑制HtrA2/Omi后对凋亡和心功能的影响。4.给予HtrA2/Omi特异性的抑制剂ucf-101可使衰老大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡减少、心功能改善4.1 Caspase-3活性测定结果Caspase-3是细胞凋亡最后通路的关键蛋白,其活性可以定量反映细胞凋亡发生情况。通过对大鼠心肌组织Caspase-3活性测定的结果表明,与给予Vehicle组的Caspase-3比活性相比,再灌注前10分钟给予ucf-101的心肌细胞Caspase-3的比活性显著降低(P＜0.05,（图32）。4.2心功能测定结果与DMSO（LVDP:0.2745±0.15;LVEDP:0.9750±1.04682:CI:20.8988±8.03547）组相比,再灌注前10分钟给予ucf-101的老年大鼠心功能指标呈明显改善的趋势（LVDP:2.825±3.46254,P=0.145）（LVEDP:4.5000±4.37798,P=0.206）（CI:30.3515±12.09784,P=0.214）,但没有统计学意义（图33,34,35）。我们经过分析,发现标准差偏大,计划加大样本量再进行实验。以上结果提示,给予ucf-101可以降低老年缺血再灌注心肌细胞Caspase-3的活性并改善心功能,这一结果为临床用药提供了一定的理论依据。小结1.衰老使大鼠心肌对缺血/再灌注损伤易感性增加:2.衰老大鼠心肌缺血/再灌注后线粒体释放HtrA2/Omi增多,XIAP含量减少。给予ucf-101能够显著抑制这种改变,改善心肌细胞损伤,保护心功能。从某种程度上提示,这可能是衰老对缺血/再灌注损伤易感性增加的原因之一。