可可粉中几种外源植物源性成分PCR检测技术的研究

论文摘要

可可粉是由可可豆直接加工制成的深加工食品,营养丰富,它是制作巧克力的重要原料,可可饮料也是当今世界3大嗜好性饮料之一。国内市场可可粉售价高,假冒伪劣现象充斥交易市场,主要掺假成分有大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳等植物下脚料,而现有的可可粉及可可制品检验检测标准只是对脂含量、蛋白含量等的检测,不能判断可可粉中有无外源植物源性成分的掺假。论文以PCR技术为基础,建立了从可可粉中检测大豆、芝麻、花生、板栗源性成分的快速鉴定技术。论文比较了2种改良CTAB法和SDS法在提取可可粉DNA中的作用。显示3种方法提取材料总DNA的产量均较高,在纯度上2种CTAB法相差不大,但SDS法稍低;在以高等植物18S rDNA为内参照基因进行PCR扩增时,2种CTAB法提取的材料DNA均能扩增出内参照基因片段,而SDS提取的组别有部分出现不能扩增出的现象。2种CTAB法均可用于可可粉材料DNA的提取。论文针对GenBank公布的大豆kti-S、芝麻oleosin、花生2S protein及板栗leafy-like等基因,利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物。分别以大豆粕、芝麻粕、花生壳及板栗壳DNA为模板,以相应基因组DNA为阳性对照,可可基因组DNA为阴性对照,通过PCR扩增筛选特异的检测引物。确定的各材料特异性引物对分别为:大豆,5’-GAAACGGCGGCACATACT-3’,5’-GGCAGACCCTTGAGAATA-3’;芝麻,5’-CCTTCC TTGGCTGTGCTCTTA-3’,5’-TTCGTCGCTTTCTTGGGTTC-3’;花生,5’-TAAGGCAAA GGGTGGAGC-3’,5’-GCAGTTCTGGGGCAAGTT-3’;板栗,5’-TAGGTTTGCGAAGAA GGC-3’,5’-CGGATAGACGGGGATGT-3’。目的片段大小分别为266 bp、153 bp、267 bp和167 bp。以上述序列为引物对扩增目的DNA片段,PCR反应体系:10×PCR缓冲液5μL,MgCl2（25 mmol/L）4μL,dNTPs（5 mmol/L）4μL,上、下游引物（10μmol/L）各2μL,Ex-Taq酶（5 U/μL）0.3μL,模板DNA 2μL（100 ng～200 ng）,加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增条件:95℃预变性5 min;随后94℃, 50 s→Ta（各引物对的相应退火温度）,1 min→72℃,45 s,43个循环;最后于72℃延伸8 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,如有目的条带出现则说明有相应的物质掺假,以此建立了检测可可粉中大豆、芝麻、花生、和板栗源性成分的PCR检测方法。该PCR检测技术可以检测50 mg以下的送检样品,在大豆粕、芝麻粕、花生壳及板栗壳的DNA溶液浓度分别为82.5 pg/μL、32.5 pg/μL、124 pg/μL和157 pg/μL时即可检出,对这几种成分掺假比例的检测最低限为0.5%、0.5%、5%和5%。该方法重复性好,适用于可可粉中大豆、芝麻、花生及板栗源性成分掺假的定性检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 我国可可粉的需求、生产和应用现状
• 1.2.1 我国可可粉的需求现状
• 1.2.2 我国可可粉的生产现状
• 1.2.3 我国可可粉的应用现状
• 1.3 国内外可可粉的检验检测现状
• 1.4 PCR 技术的原理及其在检验检疫中的应用
• 1.4.1 PCR 技术在农业检验检疫中的应用
• 1.4.2 PCR 技术在食品检验检疫中的应用
• 1.4.3 PCR 技术在医学中的应用
• 1.5 利用PCR 技术检验检测可可粉及其制品中外源植物源性成分的展望
• 1.5.1 常规PCR（Routine PCR）
• 1.5.2 多重PCR（Multiple PCR）
• 1.5.3 实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）
• 1.6 本课题研究内容
• 第二章 可可粉DNA 的提取和方法确立
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器设备
• 2.2.3 实验试剂及溶液配制
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 不同方法提取DNA 的质量、浓度
• 2.3.2 PCR 扩增内参照基因185 rDNA 片段结果
• 2.3.3 内参照基因185 rDNA PCR 扩增产物的酶切验证结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 检测可可粉外源植物源性成分时DNA 提取方法的选择
• 2.4.2 待检可可粉材料DNA 质量控制的方法选择
• 2.4.3 DNA 质量控制中PCR 检测内参照基因的选择
• 第三章 可可粉外源植物源性成分特异性引物的设计和筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 实验试剂及溶液配制
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 可可粉中外源大豆成分的不同引物对PCR 结果
• 3.3.2 可可粉中外源芝麻成分的不同引物对PCR 结果
• 3.3.3 可可粉中外源花生成分的不同引物对PCR 结果
• 3.3.4 可可粉中外源板栗成分的不同引物对PCR 结果
• 3.3.5 限制性内切酶的酶切结果
• 3.3.6 PCR 扩增产物的测序结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PCR 扩增引物的设计
• 3.4.2 PCR 检测体系的确立
• 3.4.3 PCR 检测结果的确认
• 第四章 可可粉中外源植物源性成分的PCR 定性检测
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 实验试剂及溶液配制
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 敏感性试验结果
• 4.3.2 模拟样品的检测结果
• 4.4 讨论
• 第五章 主要结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文