新型胞外多糖产生菌Phyllobacterium sp. nov. 921F及其多糖结构的研究

论文摘要

细菌胞外多糖由于其化学结构的多样性和新颖性,以及逐渐被发掘的多种新型生物学活性,受到了越来越多的科研工作者的关注。目前所报道的细菌胞外多糖主要有黄原胶、热凝胶和结冷胶三类。其结构不同,功能各异,分别应用于各个不同的领域,如食品工业、纺织工业、石油化工等方面。本论文以获得具有新型、高效且形状稳定的胞外多糖产生菌为基本目的和出发点,期望能够获得一株具有工业生产及应用的新型细菌胞外多糖。本文通过定向筛选技术获得一株胞外多糖产生菌。结合生理、生化鉴定和16SrRNA技术确定该菌株为叶杆菌属新种（Phyllobacterium sp.nov.921F）。现已申请国家专利保护——专利申请号:200710167753.1。该产糖菌株已保存于中国典型微生物培养保藏中心。由于目前尚未有相关菌种的产糖的报道,我们采用定向诱导技术和条件优化后,使得该菌株经84 h摇瓶培养后,产糖量达1.8%。在此基础上,进行10 L全自动发酵罐试验,产糖量提升至2%以上。胞外多糖提取工艺的优化方面,通过引入金属盐溶液而有效的减少了有机溶剂的加入量,显著减少了提取工艺的生产成本。以上结果表明:该菌株具有产糖量能力高、产糖性状稳定、多糖提取工艺简单且相比其它细菌胞外多糖提取能耗低等特点。达到了上游发酵工业对菌种的要求水平,具有潜在开发价值。胞外多糖理化性质和基本组成分析结果表明该多糖易溶于水,其水溶液呈透明粘稠状;多糖由半乳糖和葡萄糖组成,二者摩尔比为1.07:1;有丙酮酸基团存在;通过GPC分析得到多糖重均分子量为1082 kDa。由于该胞外多糖表现出很强的粘度特性。因此本文考察了多糖溶液浓度、剪切力、pH值、温度、放置时间、恒温加热、无机盐及蔗糖浓度对多糖溶液表观粘度的影响。结果表明该胞外多糖表观粘度受剪切速率、蔗糖浓度等因素影响较小且稳定性好,在pH 3-12之间变化不明显。随着温度的升高粘度下降。多糖的表观粘度受无机盐的影响有一定的下降,但变化程度不大。因此该多糖的粘度特性也展示出较好的应用前景。在糖链结构解析方面,本研究采用专一性酶解技术系统、准确的对糖链结构进行解析。以胞外多糖为特异性底物筛选一株降解菌进而制备专一性工具酶,以获得酶解寡糖终产物。经分离纯化制备出四、六、八糖,并通过一级质谱确定了各片段的分子量大小,结合二级质谱、核磁谱图及多糖基本性质,综合对该酶解寡糖进行了结构分析。结果证明该方法制备的寡糖具有保留糖链结构完整、准确,且结果重复性强等特点,为准确解析多糖结构提供保障。本文还对胞外多糖进行了分子水平的表征,通过轻敲模式的原子力显微技术观察到该细菌胞外多糖溶液在云母片上的构象信息,展示了单个胞外多糖分子的立体构象。该胞外多糖的水溶液在低浓度条件下,多糖分子均以单分子链的形态出现,单个分子链的高度为0.7 nm左右,链长约600 nm。最后,本文利用专一性酶解技术制备得到的具有简单重复单元的的葡半寡糖进行了一些潜在活性方面的研究,发现该寡糖在吸湿、保湿、草莓保鲜及促进种子萌发具有一定的活性。由于目前尚未有相关寡糖活性方面的报道。通过该研究不仅丰富了当前寡糖的应用前景,而且这种新型寡糖结构在理论研究方面为今后构效关系的研究提供了新的平台资源

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 1.细菌胞外多糖的分类及其结构
• 2.细菌胞外多糖的合成
• 2.1 合成机制
• 2.2 合成基因及其调控
• 3.细菌胞外多糖的研究现状
• 4.细菌胞外多糖的特性
• 4.1 增稠性
• 4.2 假塑流变性
• 4.3 凝胶性
• 4.4 改善质地及流变特性
• 4.5 稳定性
• 5.细菌胞外多糖的应用
• 5.1 食品工业
• 5.2 医药领域
• 5.3 石油工业
• 5.4 多糖构效关系
• 5.5 其它领域
• 6.细菌胞外多糖分析技术
• 6.1 多糖一级结构分析
• 6.2 多糖立体结构分析
• 7.寡糖的研究
• 7.1 寡糖的制备
• 7.2 寡糖生物学活性
• 8.研究展望
• 参考文献
• 第一章 Phyllobacterium sp.nov.921F的筛选与鉴定
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 2.方法
• 2.1 培养基
• 2.2 采样与分离
• 2.3 初筛及复筛
• 2.4 菌种的生理生化鉴定
• 2.5 菌体DNA的提取与纯化
• 2.6 16S rRNA基因的PCR扩增及测序
• 3.结果与讨论
• 3.1 菌株的筛选
• 3.2 菌株初筛结果
• 3.3 菌株复筛结果
• 3.4 形态特征
• 3.5 生理生化特性
• 3.6 16S rRNA测序结果
• 本章小结
• 参考文献
• 第二章 胞外多糖液体培养条件的优化
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验试剂
• 1.2 试验仪器
• 1.3 培养基
• 2.方法
• 2.1 液体培养基及培养条件的研究
• 2.2 多糖的测定
• 2.3 菌体生物量的测定
• 2.4 pH的测定
• 2.5 菌种生长曲线和产酶曲线的测定
• 2.6 10L全自动发酵罐实验
• 3.结果与讨论
• 3.1 标准曲线
• 3.2 培养基的确定
• 3.3 培养条件的确定
• 3.4 菌体的传代稳定性试验
• 3.5 10L全自动发酵罐实验
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 胞外多糖的分离纯化和理化性质的研究
• 第一节 胞外多糖的分离纯化
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验试剂
• 1.2 试验仪器
• 1.3 菌株
• 2.方法
• 2.1 胞外多糖的提取
• 2.2 胞外多糖的纯化
• 3.结果与讨论
• 第二节 胞外多糖的理化性质及组分分析
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验试剂
• 1.2 试验仪器
• 2.方法
• 2.1 分子量测定
• 2.2 单糖组分分析
• 2.3 糖醛酸含量测定
• 2.4 硫酸基的测定
• 2.5 多糖中丙酮酸含量测定
• 2.6 氨基糖测定
• 2.7 酮糖鉴定
• 2.8 红外光谱测定
• 2.9 胞外多糖的紫外图谱
• 2.10 胞外多糖的AFM
• 3.结果与讨论
• 3.1 多糖的物理性质
• 3.2 多糖的化学性质
• 3.3 分子量测定
• 3.4 胞外多糖的单糖组成
• 3.5 胞外多糖的红外图谱
• 3.6 胞外多糖的紫外图谱
• 3.7 胞外多糖的AFM
• 第三节 胞外多糖特性粘度研究
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验试剂
• 1.2 试验仪器
• 2.方法
• 3.结果与讨论
• 3.1 不同胞外多糖浓度溶液的表观粘度
• 3.2 不同剪切速率对表观粘度的影响
• 3.3 测定不同pH对表观粘度的影响
• 3.4 温度对胞外多糖溶液表观粘度的影响
• 3.5 放置时间对表观粘度的影响
• 3.6 恒温加热对胞外多糖溶液表观粘度的影响
• 3.7 不同盐对胞外多糖溶液表观粘度的影响
• 3.8 不同蔗糖浓度对表观粘度的影响
• 本章小结
• 参考文献
• 第四章 胞外多糖的结构分析
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 2.方法
• 2.1 胞外多糖降解菌筛选步骤
• 2.2 菌种的分离与筛选
• 2.3 胞外多糖降解酶的制备
• 2.4 低聚寡糖的酶解制备及分离纯化
• 2.5 寡糖的红外光谱分析
• 2.6 样品的还原
• 2.7 质谱分析所得寡糖序列
• 2.8 寡糖的核磁共振波谱分析
• 3.结果与讨论
• 3.1 胞外多糖降解菌的分离
• 3.2 酶解寡糖的制备
• 3.3 寡糖组分的红外图谱
• 3.4 酶解寡糖分子量的确定
• 3.5 ESI-CID-MS/MS分析
• 3.6 NMR分析
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 葡萄半乳寡糖的活性研究
• 第一节 葡萄半乳寡糖的吸湿、保湿性研究
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 2.方法
• 2.1 寡糖的吸湿性实验
• 2.2 寡糖的保湿性实验
• 3.结果与讨论
• 3.1 寡糖吸湿性
• 3.2 寡糖保湿性
• 第二节 葡萄半乳寡糖在草莓保鲜方面的研究
• 引言
• 1.材料与仪器
• 2.方法
• 3.结果与讨论
• 第三节 寡糖对碗豆、蚕豆种子的萌发和促生长研究
• 引言
• 1.材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验试剂
• 1.3 试验仪器
• 2.方法
• 2.1 种子的处理
• 2.2 置床、发芽
• 2.3 根长、芽长的测定
• 2.4 根、芽淀粉酶活力的测定
• 2.5 叶绿素a,b含量的测定
• 2.6 蛋白含量测定
• 2.7 可溶性总糖含量的测定
• 3.结果与讨论
• 3.1 寡糖对碗豆、蚕豆种子根、芽的影响
• 3.2 寡糖对碗豆、蚕豆叶片的影响
• 本章小结
• 参考文献
• 结语
• 一、产糖菌种及其多糖理化性质
• 二、细菌多糖的结构研究
• 三、多糖的发酵生产条件及其产业化价值
• 四、寡糖素活性及其应用
• 五、展望
• 创新点
• 博士期间工作成果
• 致谢