固定化酶膜反应器藕合错流萃取色谱制备5’-核苷酸

论文摘要

本文针对5’-磷酸二酯酶水解酵母RNA制备5’-核苷酸工艺中存在的技术问题,开展了对酶制剂制备技术及RNA酶解工艺的改进研究。改进了酶活性的测定方法,研究了从麦芽根中浸取和提纯5’-磷酸二酯酶的技术以及RNA酶解反应动力学,探索了麦芽根5’-磷酸二酯酶的固定化方法,进一步研究了该固定化酶在膜反应器中水解酵母RNA的工艺,并设计了一种新的连续错流萃取色谱分离系统,用于复杂酶解产物的分离。研究工作和主要结果如下：改进了传统的测定5’-磷酸二酯酶酶活的UV-RNA法,提出了HPLC-RNA酶活测定法。该方法的特点是：1)能测定混合酶中5’-磷酸二酯酶的酶活；2)精密度高,性线范围大。当麦芽根的蛋白质浓度在0.02～1.20 mg/mL范围内时,蛋白质浓度与5’-核苷酸产量的线性相关系数R=0.9997,相对标准偏差（R.S.D）为5.7%。采用正交实验法优化了从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶的操作条件。最佳条件为：麦芽根粒径120目,浸取液pH=7,浸取温度10℃,麦芽根：水=1：16（质量比）,浸取时间5 h。在该条件下,每克麦芽根提取的总酶活为4470 U,5’-磷酸二酯酶的单位酶活为280 U/mL。采用硫酸铵沉淀、超滤浓缩、透析膜脱盐,以及Sephadex G-25、Sephadex G-75凝胶层析提纯,获得了比酶活为0.02137 mmol/ （mgxmin）的5’-磷酸二酯酶制剂,比未经硫酸铵沉淀的粗酶液的比酶活提高了6倍。探讨了5’-磷酸二酯酶催化水解RNA的反应机理,研究了酶的主要酶学特征值。实验测得米氏常数Km=8.73 mg/mL（底物为RNA）,最大反应速度Vmax=14.27×10-3 mg/（mL·min）,酶的最适pH值为5.0,最适温度为70℃。考察了酶的稳定性,发现5’-磷酸二酯酶在pH值为5-7的范围内比较稳定,短时间置于较高的温度（50-70℃）下,能保持较高的酶活。在酶液中加入金属离子一股都会导致酶活下降,但镁离子有促进酶活的效应,体现了与桔青霉5’-磷酸二酯酶不同的特性。5’-核苷酸是麦芽根5’-磷酸二酯酶的抑制剂,不断移除RNA酶解反应产物中的5’-核苷酸,有利于酶解反应的进行。采用戊二醛活化的壳聚糖为载体,固定了麦芽根5’-磷酸二酯酶。试验结果表明,当酶固定化温度为30℃、固定化酶pH值为5.0、固定化时间为6h的最适条件下,最高的酶活回收率可达53.6%。所制得的固定化酶的最适温度为75℃,最适pH值为5.5。研究表明,固定化酶比游离酶更纯,酶的固定化过程也起到了提纯酶的作用。研究了固定化5’-磷酸二酯酶的酶学性质,测得固定化酶的米氏常数Km为15.38 mg/mL（底物为RNA）设计装配了一种管式固定床反应器（CPFR）与中空纤维超滤膜相耦合的反应-分离装置。考察了反应温度、pH值、底物浓度等因素对反应进程的影响。酶解反应的最适操作条件为：反应温度为75℃,pH值为5.5,RNA浓度控制在3%以内。在反应-分离耦合装置上进行了较长时间连续酶解RNA的操作,核苷酸的总收率达到了88.3%。反应结束后,固定化5’-磷酸二酯酶能保持原酶74.6%的活性,表明固定化酶具有良好的稳定性。发明了一种连续错流萃取色谱分离系统,推导出了该系统重相出口和轻相出口中的流出色谱图的数学表达式（流出曲线）,从理论上证明该系统能够连续、大处理量、高选择性地分离多组分复杂混合物。采用6×6的错流萃取色谱分离系统分离了5’-AMP和苯甲酸的混合物,实验结果与理论计算值相当吻合,证明该系统能实现混合物的高分辨分离。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 核苷酸的性质及研究现状
• 1.1.1 核苷酸的结构及性质
• 1.1.2 核苷酸的应用状况
• 1.1.3 核苷酸的制备技术及研究进展
• 1.2 5'-磷酸二酯酶的研究现状
• 1.2.1 从桔青霉（Penicillium citrinum）发酵制备5'-磷酸二酯酶
• 1.2.2 从麦芽根中提取的5'-磷酸二酯酶
• 1.2.3 从其它途径提取的5'-磷酸二酯酶
• 1.3 磷酸二酯酶固定化技术的研究进展
• 1.3.1 核酸酶P1的固定化
• 1.3.2 麦芽根5'-磷酸二酯酶的固定化
• 1.4 酶膜反应器中核酸酶水解RNA的研究进展
• 1.5 本文研究内容及方案
• 1.5.1 研究目标及意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 1.5.3 研究方法
• 1.5.4 拟解决的关键问题
• 第二章 5'-磷酸二酯酶的酶活测定
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 色谱分析条件
• 2.1.2 酶活的测定
• 2.1.3 大麦的发芽及5'-磷酸二酯酶的提取
• 2.1.4 粗酶的热击除杂酶
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 色谱分离条件的优化
• 2.2.2 酶解产品中核苷酸的HPLC定量分析
• 2.2.3 RNA-HPLC酶活测定方法的建立
• 2.2.4 RNA-HPLC酶活测定法在热击提纯酶过程中的应用
• 2.3 本章小结
• 第三章 5'-磷酸二酯酶的提取和纯化
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 实验试剂与仪器
• 3.1.2 酶活的测定
• 3.1.3 大麦的发芽及5'-磷酸二酯酶的浸取
• 3.1.4 粗酶的热击除杂酶
• 3.1.5 蛋白质含量的测定
• 3.1.6 超滤浓缩粗酶液
• 3.1.7 硫酸铵沉淀
• 3.1.8 透析除盐
• 3.1.9 Sephadex G-25凝胶层析
• 3.1.10 Sephadex G-75凝胶柱层析
• 3.1.11 酶液的冷冻干燥
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 粗酶浸取条件的优化
• 3.2.2 凝胶层析分离
• 3.3 本章小结
• 第四章 5'-磷酸二酯酶的酶学特性及催化水解RNA的动力学研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 主要仪器及试剂
• 4.2.2 色谱分析条件
• 4.2.3 酶活的测定
• 4.2.4 核苷酸标准品溶液的配制
• 4.2.5 测定米氏常数及最大反应速度
• 4.2.6 5'-磷酸二酯酶水解RNA
• 4.3 酶催化动力学基础分析
• 4.4 5'-磷酸二酯酶的催化水解RNA的可能反应机理
• 4.5 5'-磷酸二酯酶动力学及热力学实验
• 4.5.1 pH对反应过程的影响及酶的最适pH值
• 4.5.2 温度对反应过程的影响及酶的最适温度
• 4.5.3 动力学常数的测定
• 4.5.4 麦芽根5'-磷酸二酯酶的稳定性
• 4.5 本章小结
• 第五章 麦芽根5'-磷酸二酯酶的固定化
• 5.1 引言
• 5.2 试验部分
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 HPLC分析条件
• 5.2.3 5'-磷酸二酯酶的提取
• 5.2.4 活性壳聚糖载体的制备
• 5.2.5 活化载体固定5'-磷酸二酯酶
• 5.2.6 酶活的测定
• 5.2.7 回收率的测定
• 5.2.8 蛋白质含量的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 壳聚糖载体活化条件的确定
• 5.3.2 活化壳聚糖载体固定化酶的反应条件
• 5.3.3 固定化5'-磷酸二酯酶的酶学性质
• 5.4 本章小结
• 第六章 酶膜反应器中水解RNA的工艺研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 主要仪器及设备
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 5'-核苷酸HPLC分析条件
• 6.2.4 活性壳聚糖载体的制备
• 6.2.5 活化载体固定5'-磷酸二酯酶
• 6.2.6 酶活的测定
• 6.2.7 回收率的测定
• 6.2.8 膜通量的测定
• 6.2.9 截留率的测定
• 6.2.10 RNA酶解率的计算
• 6.2.11 酶膜反应器生产能力的计算
• 6.2.12 RNA含量测定
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 膜材料的选择
• 6.3.2 膜反应器中酶的固定及膜反应器的设计
• 6.3.3 酶解RNA的CPFR反应操作条件的优化
• 6.3.4 膜污染及其控制
• 6.3.5 膜反应器连续酶解RNA的性能
• 6.4 本章小结
• 第七章 错流萃取色谱模型的建立、理论分析及验证
• 7.1 前言
• 7.2 模型的建立
• 7.3 模型的理论验证
• 7.3.1 重相浓度变化曲线
• 7.3.2 轻相浓度变化曲线
• 7.3.3 组分的分离
• 7.4 模型的实验验证
• 7.4.1 实验部分
• 7.4.2 数据处理
• 7.5 本章结论
• 第八章 结论与展望
• 8.1 主要结论及创新点
• 8.2 展望及努力方向
• 参考文献
• 攻读博士学位期间撰写的文章
• 致谢