论文题目: XIAP反义寡核苷酸诱导急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞凋亡及逆转耐药的实验研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 内科学
作者: 王晓芳
导师: 王椿,颜式可,高彦荣
关键词: 白血病,反义寡核苷酸,凋亡,耐药,纤维连接蛋白,黏附
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 论文第一部分：我们观察了X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(AS ODNs)对急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性的影响。将人工合成的XIAP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体-反义寡核苷酸复合物的形式转染HL-60细胞。应用CCK-8实验检测反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及对柔红霉素敏感性的影响，RT-PCR和Western blot技术检测HL-60细胞XIAP的mRNA和蛋白的变化，JC-1检测细胞线粒体膜电位变化，流式细胞仪Annexin V／PI双染色法检测细胞的凋亡率，比色法检测细胞内Caspase-3活性改变。结果表明：(1)XIAPAS ODNs能够抑制HL-60细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性；(2)XIAP AS ODNs使HL-60细胞的mRNA和蛋白表达均明显下调，mRNA较对照组减少了77.78％，蛋白较对照组减少了73.33％；(3)XIAP AS ODNs使HL-60细胞线粒体膜电位下降，细胞浆荧光由红色转变为绿色；(4)XIAP AS ODNs组HL-60细胞的凋亡率为52.73％，错义链组为11.99％，两组相比，差异具有显著性(P＜0.05)；(5)XIAP AS ODNs使HL-60细胞Caspase-3活性明显增高，与对照组比较具有统计学意义(0.961±0.022 vs 0.055±0.008，P＜0.05)；(6)XIAP AS ODNs使HL-60细胞对柔红霉素的敏感性增加，900nmol／L XIAP反义寡核苷酸与0.5ug/ml柔红霉素联合作用72小时，对HL-60细胞的杀伤率为86.57％，高于XIAP反义寡核苷酸组的56.59％(P＜0.05)和柔红霉素组的63.05％(P＜0.05)。结果提示XIAP可能参与了白血病细胞的增殖和凋亡机制，通过下调XIAP有可能为抑制白血病细胞增殖、促进凋亡和增加对化疗药物的敏感性提供新的途径。论文第二部分：我们探讨了XIAP在纤维连接蛋白(FN)黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用，观察XIAP反义寡核苷酸对其逆转作用。我们用FN包被培养板，同时以牛血清白蛋白(BSA)包被培养板作为对照。通过CCK-8实验检测FN黏附对柔红霉素敏感性的影响，流式细胞仪检测FN黏附后HL-60细胞内DNR浓度的变化，RT-PCR、Westem blot分别检测FN黏附对HL-60细胞XIAP、BCL-2、MRP和MDR1的mRNA和蛋白表达的影响。并将人工合成的XIAP全硫代反义寡核苷酸，通过脂质体途径转染与FN黏附培养的HL-60细胞，CCK-8实验计算细胞杀伤率，根据DNR浓度对数与细胞杀伤率之间的线性回归方程计算IC50值，RT-PCR、Westem blot检测XIAP的mRNA和蛋白变化。结果表明，HL-60细胞与FN黏附后，对柔红霉素的敏感性下降，FN组IC50为0.526umol／L，明显高于BSA组(0.132umol／L)和悬浮培养组(0.123umol／L)(P＜0.05)；RT-PCR和Western blot结果显示，FN黏附组HL-60细胞的XIAP在mRNA和蛋白水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调(P＜0.05)，而BCL-2、MRP和MDR1的表达与后两组无明显差别(P＞0.05)；流式细胞仪检测显示，FN黏附组HL-60细胞内的DNR浓度与BSA黏附组和悬浮对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。XIAP反义寡核苷酸使FN黏附介导耐药的HL-60细胞XIAP的mRNA和蛋白表达均明显下调，对柔红霉素的敏感性增加。上述结果提示，XIAP可能参与了FN黏附介导的HL-60细胞耐药的发生，应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转FN黏附介导的HL-60细胞的耐药。论文第三部分：我们探讨了HL-60／ADR细胞的耐药机制，比较XIAP和MRP反义寡核苷酸单独应用及二者联合应用对HL-60／ADR细胞耐药的逆转作用。应用RT-PCR和Western blot技术检测并比较HL-60细胞和HL-60／ADR细胞的BCL-2、XIAP、MDR1、MRP在mRNA和蛋白水平表达的差异。将XIAP和MRP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体-反义寡核苷酸复合物的形式，单独或联合转染HL-60／ADR细胞，应用CCK-8实验测定反义寡核苷酸对DNR敏感性影响；RT-PCR和Western blot检测反义寡核苷酸对XIAP、MRP的mRNA和蛋白表达的影响。结果显示，HL-60／ADR细胞的MRP和XIAP的表达均明显高于HL-60细胞。XIAP反义寡核苷酸和MRP反义寡核苷酸单独应用能够分别下调XIAP和MRP的表达，增加对柔红霉素的敏感性；二者联合应用与XIAP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能增强对XIAP表达的抑制作用(P＞0.05)，但使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P＜0.05)；二者联合应用与MRP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能提高HL-60／ADR细胞内DNR浓度及增强对MRP表达的抑制作用，却使HL-60／ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P＜0.05)。上述结果提示，XIAP和MRP都可能参与了HL-60／ADR细胞的耐药机制，联合应用针对二者的反义寡核苷酸能更大程度逆转HL-60／ADR细胞的耐药。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
前言参考文献
第一部分:XIAP反义寡核苷酸促进HL-60细胞凋亡并增加其对化疗药物敏感性
引言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第二部分:XIAP在纤维连接蛋白黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用
引言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第三部分:MRP和XIAP反义寡核苷酸联合逆转HL-60/ADR细胞耐药
引言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
全文总结
附录一:综述
附录二:在校期间发表论文及曾获奖励
附录三:致谢
发布时间: 2007-06-28
参考文献
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