单核苷酸多态性分子标记在柑橘杂种区分中的应用

论文摘要

柑橘多胚现象频发,以致杂交育种后代中多是珠心苗,要获得杂种实生苗殊为不易。因此,很有必要在杂种早期对有性和无性后代进行有效的区分,以提高育种效率,降低培育成本。DNA分子标记是最为有效的有性苗鉴定方法。在本研究中,我们试图依靠单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）分子标记来鉴定珠心苗和有性苗。主要采用了两种SNP标记检测方法：单链构象多态性PCR （Single Strand Conformation Polymorphism PCR, SSCP-PCR）和等位基因特异PCR （Allele Specific PCR）。在本研究中,一共配置了5个杂交组合：即少核默科特×418红桔、少核默科特×兴义大红袍红桔、江津柳橙×兴义大红袍红桔、砂糖桔×兴义大红袍红桔、兴义大红袍红桔×砂糖桔。待杂交果实成熟后取种播种育苗,以作杂种区分试验用材。为寻找可用于杂种区分的SNP标记,我们克隆了418红桔和少核默科特的9个类胡萝卜素合成酶基因。通过分析发现了具有多个SNP位点的基因,即p-胡萝卜素羟化酶（β-carotene hydroxylase, CHX）基因。在CHX基因序列上,杂交亲本418红桔和少核默科特含有不同的SNP,但无法用于Allele Specific PCR引物的设计中,因为SNP位点不合适。用PCR-SSCP的方法可区分开一部分的杂交苗,并不能全部区分开。根据序列分析,认为用Allele Specific PCR的方法可区分开少核默科特和兴义大红袍红桔、兴义大红袍红桔和砂糖桔、江津柳橙和兴义大红袍红桔。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1.1 DNA分子标记技术
• 1.1.1 DNA分子标记的发展史
• 1.1.2 DNA分子标记的特点
• 1.1.3 DNA分子标记的应用
• 1.1.4 DNA分子标记在柑橘中的应用
• 1.2 单核苷酸多态性分子标记在植物研究中的应用进展
• 1.2.1 单核苷酸多态性分子标记的定义及特点
• 1.2.2 SNP标记的发掘方法
• 1.2.3 SNP标记在果树研究中的应用进展
• 第二章 引言
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 主要技术路线图
• 第三章 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 试剂盒
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 柑橘材料
• 3.2 常规试验方法
• 3.2.1 DNA的提取方法
• 3.2.2 简单且快速的方法粗提取DNA
• 3.2.3 总RNA的提取
• 3.2.4 反转录及PCR反应体系
• 3.2.5 琼脂糖凝胶电泳纯化回收DNA片段
• 3.2.6 TA克隆、大肠杆菌感受态细胞的转化及测序
• 3.2.7 SSCP实验方法
• 3.2.8 花粉活力测定法
• 3.2.9 杂交授粉方法
• 3.2.10 胚抢救实验方法
• 3.2.11 幼苗的高接方法
• 3.3 柑橘杂交预实验
• 3.3.1 胚抢救及高接
• 3.3.2 杂交亲本类胡萝卜素合成相关基因cDNA的克隆测序
• 3.4 柑橘杂交实验
• 3.4.1 采集父本花粉
• 3.4.2 父本花粉活力的测定
• 3.4.3 杂交授粉
• 3.4.4 胚抢救
• 3.4.5 嫁接
• 3.4.6 用Allele Specific PCR法区分杂交亲本
• 第四章 结果与分析
• 4.1 柑橘杂交预实验
• 4.1.1 柑橘杂交预实验胚抢救结果
• 4.1.2 亲本色素基因的cDNA克隆的结果与分析
• 4.2 杂交实验的结果与分析
• 4.2.1 父本花粉活力测定的结果与分析
• 4.2.2 杂交授粉及坐果率的结果与分析
• 4.2.3 对杂交幼果胚抢救的结果与分析
• 4.2.4 对成熟的果子进行胚抢救的结果与分析
• 4.2.5 嫁接
• 4.2.6 根据亲本已克隆的CHX的基因组序列的SNP位点区分亲本
• 第五章 讨论与结论
• 5.1 杂交预实验
• 5.2 杂交实验
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间发表文章及参研项目
• 发表的文章
• 参研项目
• 参加的重要学术会议