论文摘要
背景:胶质瘤是中枢神经系统内最常见的恶性肿瘤,占颅内肿瘤的40%-50%。其呈侵袭性生长,总体疗效不佳,尤其是高分级胶质瘤,具有高度问变的生长特点,术后复发快、预后差,严重威胁人类健康,是神经外科治疗中相对棘手的难治性肿瘤之一。增殖的微血管对胶质瘤的恶性生物学行为起着重要作用。在胶质瘤的分级标准中,将血管的形态学改变作为恶性指标之一,明显不同于颅外其他肿瘤,无疑将血管生成在该瘤中的作用上升到一个新的高度。目前抗血管生成作为肿瘤治疗的新方法,已迅速发展为重要的抗癌策略,并成为肿瘤治疗领域的研究热点。在经手术切除、放疗和化疗等综合治疗仍无法从根本上改善胶质瘤预后的情况下,抗血管生成治疗有可能成为改善胶质瘤预后的突破口。fibulin-5是细胞外基质蛋白家族fibulin家族中的成员,亦称为FBLN-5、DANCE或EVEC,在人染色体中位于14q32.1,其蛋白大小约60KDa。fibulin-5是一种含有448个氨基酸的糖蛋白,含有6个与钙离子结合的表皮生长因子样（EGF-like）区域,其中一个区域含有能与整合素结合的RGD基序（integrin-binding RGD motif）。后者能介导内皮细胞粘附,能与细胞表面的整合素αvβ3、αvβ5和α9β1结合。fibulin-5广泛分布于富含弹性蛋白的组织中,能直接与弹性蛋白原（tropoelastin）结合,或者连接微原纤维（microfibril）,在形成弹性纤维过程中具有重要作用,而且可以影响血管的发育和修复。此外,fibulin-5还能通过促进组织肉芽增生和Ⅰ型胶原表达来促进伤口愈合;这与细胞的增殖、运动和侵袭有关。因此既往对其研究主要集中在弹性蛋白病变方面,对其缺失或基因突变而导致的多种皮肤、血管和肺组织疾病已经有了充分的共识,认为它是治疗血管硬化、肺气肿和皮肤松弛症等疾病的重要靶点。有研究指出fibulin-5可以促进人HT1080纤维肉瘤细胞的DNA合成,并增强其侵袭基底膜的能力;但是在肾癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌等恶性肿瘤中,fibulin-5的表达明显降低。另有实验发现fibulin-5能通过抑制肿瘤血管生成来减缓老鼠癌性肿瘤的生长。这些研究显示fibulin-5的表达与肿瘤发生、发展和血管生成存在紧密联系。但是目前fibulin-5对肿瘤细胞的生物学特性的影响还不甚清楚;在肿瘤血管生成中的具体调控机制还有待进一步研究;在胶质瘤中的表达及作用在国内外亦未见到相关报道。HUVEC-2C是经典的血管内皮细胞模型,U251是来源于多形性胶质母细胞瘤WHOⅣ级的细胞株。因此在本文中,我们拟首先探讨fibulin-5在人脑胶质瘤中的表达情况。然后拟通过体外单纯血管内皮细胞模型（HUVEC-2C）以及Transwell培养技术构建的HUVEC-2C和U251共培养的胶质瘤微环境模型探讨fibulin-5与胶质瘤发生、发展的关系。第一章fibulin-5在人脑胶质瘤组织中的表达及意义目的:初步探讨fibulin-5在胶质瘤中的表达情况及其与胶质瘤发生、发展的关系。方法:通过免疫组织化学方法检测fibulin-5蛋白、Ki-67,FactorⅧ及HIF-1α蛋白在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达情况,并分析fibulin-5蛋白的表达与胶质瘤的病理分级、胶质瘤Ki-67标记指数（Ki-67 LI）、微血管密度（MVD）及HIF-1α蛋白表达的关系。实验分三组:对照组为正常脑组织（7例）、低分级胶质瘤组（21例WHO分类Ⅰ～Ⅲ级的胶质瘤石蜡标本）和高分级胶质瘤组（19例WHO分类Ⅲ～Ⅳ级的胶质瘤石蜡标本）。通过RT-PCR检测fibulin-5 mRNA在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达情况。实验分三组:对照组为正常脑组织（7例）、低分级胶质瘤组（22例WHO分类Ⅰ～Ⅱ级的新鲜胶质瘤标本）和高分级胶质瘤组（15例WHO分类Ⅲ～Ⅳ级的新鲜胶质瘤标本）。结果:fibulin-5蛋白主要分布于细胞之间,偶可在实质细胞及血管内皮细胞胞浆中发现表达。均表现为黄色或棕黄色着色。fibulin-5蛋白在对照组正常脑组织中,所有7例标本均检测到表达;在低分级胶质瘤组中,21例标本有13例检测到表达;在高分级胶质瘤组中,19例标本有4例检测到表达。正常脑组织标本的fibulin-5蛋白表达阳性率以及平均IRS值和低分级胶质瘤组相比无统计学差异（P＞0.05）;高分级胶质瘤组的fibulin-5蛋白表达阳性率以及平均IRS值均低于正常脑组织和低分级胶质瘤组的表达,统计学检测有差异（P＜0.05）。在有经验的病理科医师指导下,观察实验各组的阳性标本,可以发现fibulin-5蛋白在组织血管中表达的位置是不一样的,在正常脑组织中主要表达于管径较大的血管;在低分级胶质瘤中主要表达于管径微小的血管;在高分级胶质瘤中未发现在组织血管表达。fibulin-5 mRNA在对照组正常脑组织中,所有7例标本均检测到表达;在低分级胶质瘤组中,22例标本有14例检测到表达;在高分级胶质瘤组中,15例标本有3例检测到表达。正常脑组织标本的fibulin-5 mRNA表达阳性率以及平均IOD值和低分级胶质瘤组相比无统计学差异（P＞0.05）;高分级胶质瘤组的fibulin-5 mRNA表达阳性率以及平均IOD值均低于正常脑组织和低分级胶质瘤组的表达,统计学检测有差异（P＜0.05）。在胶质瘤组织中,fibulin-5蛋白和mRNA在不同性别及年龄的表达无统计学差异（P＞0.05）。同时直线相关分析发现,fibulin-5蛋白在胶质瘤中的表达与胶质瘤的病理分级、MVD、HIF-1α及Ki-67均存在负相关（r=-0.455,-0.779,-0.320;P=0.003,0.000,0.044）。结论:fibulin-5在正常脑组织中表达,其在胶质瘤组织中表达的变化可能与胶质瘤的进展和血管生成存在联系。第二章构建人fibulin-5基因表达的慢病毒质粒并感染HUVEC—2C筛选混合稳定株目的:构建人fibulin-5基因表达的慢病毒质粒并感染HUVEC—2C筛选混合稳定株,为体外研究fibulin-5的生物学功能提供材料。方法:通过RT-PCR检测fibulin-5 mRNA在HUVEC-2C和U251细胞株的表达。通过构建含有fibulin-5的重组pGC-FU载体,并用293T细胞包装病毒,将得到的人fibulin-5基因表达的慢病毒质粒感染HUVEC-2C并筛选,最终得到人fibulin-5基因表达的HUVEC-2C混合稳定株。结果:fibulin-5 mRNA在HUVEC-2C和U251细胞株均不表达。在人fibulin-5基因表达的HUVEC-2C混合稳定株中,通过Western blot和Real-time PCR方法检测到fibulin-5的表达。结论:成功建立了人fibulin-5基因表达的HUVEC-2C混合稳定株,为进一步实验做准备。第三章人fibulin-5基因表达对内皮细胞生物学特性的影响目的:探讨人fibulin-5基因表达对内皮细胞生物学特性的影响,以明确其在血管生成中的作用及机制。方法:实验分3组:CON组（未作任何干扰的HUVEC-2C细胞株）;NC组（阴性对照慢病毒感染HUVEC-2C筛选的混合稳定细胞株）;KD组（人fibulin-5基因表达的慢病毒质粒感染HUVEC-2C筛选的混合稳定细胞株）。通过MTT法、结晶紫染色法、流式细胞仪分析法和成管能力实验检测人fibulin-5基因表达对HUVEC-2C的增殖、粘附、迁移、凋亡和成管能力的影响。结果:MTT检测发现在相同的时问点,KD组的OD值明显低于CON组和NC组（P＜0.05）;检测粘附能力试验中,接种30min后KD组结晶紫OD值明显高于CON组和NC组（P＜0.05）;检测迁移能力实验中,KD组结晶紫OD值明显低于CON组和NC组（P＜0.05）;培养至第3天进行流式细胞仪检测可见,KD组HUVEC细胞G0/G1期分布明显多于NC组和CON组（P＜0.05）;S期分布明显少于NC组和CON组（P＜0.05）:G2/M期分布和细胞凋亡率三组无明显差别（P＞0.05）。检测成管能力实验中,CON组、NC组及KD组管状结构相对面积并无明显差异（P=0.305）,但是KD组HUVEC-2C成管数明显低于CON组和NC组（P<0.05）。在检测增殖、粘附、迁移、凋亡及成管能力实验中,CON组和NC组无明显差异（P>0.05）。结论:人fibulin-5基因表达后,可以使内皮细胞的细胞周期迟滞;抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管能力;可以增强内皮细胞的粘附能力。其可能通过减少血管基底膜的溶解、维持细胞外基质的稳定性、增强内皮细胞的粘附能力来抑制血管新生和维护原有血管的稳定。第四章人fibulin-5基因表达对胶质瘤-内皮细胞微生态系统中内皮细胞和肿瘤细胞生物学特性的影响目的:探讨人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达对内皮细胞和肿瘤细胞生物学特性的影响,以明确其在胶质瘤发生、发展中的作用。方法:用Transwell技术体外建立了U251细胞与HUVEC共培养模型。实验分3组:CON组（其中HUVEC-2C未加任何干扰因素）;NC组（其中HUVEC-2C是阴性对照慢病毒感染HUVEC-2C筛选的混合稳定细胞株）;KD组（其中HUVEC-2C是人fibulin-5基因表达的慢病毒质粒感染HUVEC-2C筛选的混合稳定细胞株）。通过MTT法、结晶紫染色法和成管能力实验检测人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达对HUVEC-2C的增殖、粘附、迁移和成管能力的影响。通过MTT法和结晶紫染色法检测人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达对U251的增殖和迁移能力的影响。结果:①在检测人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达对HUVEC-2C生物学功能影响的实验中发现:MTT法结果示在相同的时间点,KD组的OD值明显低于CON组和NC组（P＜0.05）;检测粘附能力试验中,接种30min后KD组结晶紫OD值明显高于CON组和NC组（P＜0.05）;检测迁移能力实验中,KD组结晶紫OD值明显低于CON组和NC组（P＜0.01）;检测成管能力实验中,CON组,NC组及KD组管状结构相对面积并无明显差异（P=0.996）,但是KD组HUVEC-2C成管数明显低于CON组和NC组（P＜0.05）,KD组的管型结构更加规则。在检测增殖、粘附、迁移及成管能力实验中,CON组和NC组无明显差异（P＞0.05）。②在检测人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达对U251生物学功能影响的实验中发现:MTT法结果示从培养48小时后开始,在相同的时间点,KD组的OD值明显低于CON组和NC组（P＜0.05）,CON组和NC组的OD值无明显差异（P＞0.05）;检测迁移能力实验中,CON组、NC组和KD组结晶紫OD值比较无明显差异（P=0.819）结论:人fibulin-5基因在胶质瘤微环境中表达可抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管能力;可以增强内皮细胞的粘附能力。其可抑制血管新生和维护原有血管的稳定,并有可能使“肿瘤血管相对正常化”;此外,它还可以抑制U251的增殖,从而抑制肿瘤的增殖和转移。
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